益生菌中短链脂肪酸的合成途径及功能性研究

卜子晨，夏永军，艾连中，熊智强，宋馨，王光强

(上海理工大学 健康科学与工程学院，上海食品微生物工程技术研究中心，上海，200093)

益生菌是指摄入大量会对宿主生命和健康产生有益功效的微生物[1]。许多研究表明，益生菌能够通过体内细菌数量的平衡和良好的新陈代谢的促进来铸造健康且稳定的肠道环境,能够调节宿主的防御，预防传染病，缓解消化道部分慢性炎症[2]。所以益生菌常被认为是一种具有预防力和治疗代谢相关疾病的一种有潜力的工具，而益生菌微生物的生长和代谢活性可被宿主未消化的各种碳水化合物(益生元)选择性地刺激。在人类结肠模型系统中，益生菌与益生元的组合能够改变优势细菌和粪便微生物的短链脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)的生产[3]。SCFAs是一组挥发性脂肪酸，参与人体代谢，并在肝脏、骨骼肌、脂肪组织和胰岛等不同器官中具有重要功能[4]。SCFAs可直接影响碳水化合物代谢和脂质利用，并通过副交感神经系统间接调节能量代谢，缓解肥胖和糖尿病症状，限制炎症并抑制肿瘤细胞生长[5]。SCFAs参与调节性T细胞(Tregs)的发育并影响巨噬细胞的活性，以及抗炎细胞因子如IL-10，IL-4的产生，血浆B细胞的增殖，通过抑制组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)和激活GPR109A、GPR43、GPR41等，最终发挥抗炎作用，并对微生物病原体产生耐受性[6]。大量实验证明益生菌可以有效调节肠道微生物组并对结肠中SCFAs含量有影响，且研究人员强调益生菌产生的SCFAs具有免疫调节作用，但其作用机制仍需进一步研究。利用益生菌预防和治疗肠道失调，使结肠中SCFAs含量增加，似乎是进一步研究的重要方向。

1 短链脂肪酸

1.1 短链脂肪酸的特点

SCFAs是肠道细菌从内源或饮食来源发酵碳水化合物和蛋白质的最终产物。它们由2～6个碳的饱和脂肪酸组成，包括乙酸(C2)、丙酸(C3)、丁酸(C4)、异丁酸(iC4)、戊酸(C5)、异戊酸(iC5)和己酸(C6)。其中乙酸、丙酸、丁酸含量最高，占所有SCFAs 中的90%～95%[7]。短链脂肪酸的产生可能受到多种因素的调节，包括膳食摄入中存在的微生物群的数量和类型、底物来源和肠道运输时间。其主要产生部位是结肠，大多在近端结肠(70～140 mm)释放浓度非常高，远端结肠(20～70 mm)和回肠末端(20～40 mm)浓度较低[8]。结肠中乙酸、丙酸和丁酸的摩尔比为60∶25∶15，比例会因饮食、菌群组成、发酵位点和宿主基因型等因素而变化。丁酸主要被结肠细胞利用，而乙酸和丙酸通过门静脉到达肝脏。丙酸随后被肝细胞代谢，而乙酸则留在肝脏或被系统释放至外周静脉系统[9]。

1.2 短链脂肪酸在益生菌中的分布

益生菌，益生元，特别是两者的结合，在SCFAs酸的形成中发挥着最重要的作用。SCFAs多是由没有消化吸收的食物残渣中的碳水化合物经结肠内厌氧菌酵解产生，其中产SCFAs的益生菌主要包括乳杆菌、双歧杆菌和丁酸梭菌等。PENG等[10]研究表明饲料中添加植物乳杆菌B1可以增加肠道中乳酸菌的数量，它们可以产生更多的乳酸和SCFAs，并能降低盲肠中大肠杆菌的水平。OYARZABAL等[11]研究表明乳酸菌在含2.5 g/L乳糖的培养基上产生45 μmol/mL的乳酸和SCFAs，从而降低环境的pH值，减少其他有害菌生长。双歧杆菌主要通过发酵途径产生SCFAs，其中山药低聚糖在模拟结肠环境中可被植物乳杆菌和双歧杆菌等肠道益生菌作为碳源利用，其中乙酸在双歧杆菌48 h的发酵液中含量高达1.85 mg/mL，丙酸在双歧杆菌8 h发酵液中含量高达0.082 mg/mL[3]。梭菌属的许多微生物都能产生丁酸作为主要的发酵产物，比如丁酸梭菌和酪酸梭菌以及嗜热的热丁酸梭菌常被用来生产约10 g/L的丁酸[12]。其中当强化梭基培养基pH值控制在6.5时，拜氏梭菌Br21发酵木糖唯一的产物就是丁酸。所以工业上常控制pH值来提高Br21的丁酸含量。

1.3 益生菌短链脂肪酸的合成路径

研究表明，益生菌在SCFAs的生产中起着至关重要的作用，不同的细菌合成SCFAs的效率不同。产生SCFAs的途径有很多种(图1)，细菌中产生SCFAs最普遍的途径是通过糖酵解途径，某些细菌类群如双歧杆菌也可以利用磷酸戊糖途径产生相同的代谢物。肠道微生物通过结肠发酵过程中以3∶1∶1的化学计量生成乙酸、丙酸和丁酸。乙酸是结肠中含量最多的SCFAs，占粪便中SCFAs的一半以上。其中乙酸通常通过乙酰辅酶A或Wood-Ljungdahl途径从丙酮酸中生成乙酸,常见的是由乙酰辅酶A衍生，将CO2还原为CO生成[13]。丙酮酸或乙酰辅酶A产醋酸主要依赖于磷酸乙酰转移酶(pta编码)和醋酸激酶(ackA编码)。乙酸也可以通过Wood-Ljungdahl途径由氢和CO2或甲酸合成而形成乙酸，约占总量的1/3[14]。MILLER和WOLIN利用放射性同位素分析表明，细菌如产气荚膜梭菌和嗜热链球菌等生产乙酸的主要途径是Wood-Ljungdahl途径，这被认为是最有效的乙酸生产途径。丙酸发酵的主要底物是葡萄糖和乳酸，常见的合成途径主要有3种，拟杆菌一般是通过甲基丙二酰辅酶A利用琥珀酸途径形成丙酸[15]。这一途径中的限制酶是从磷酸烯醇丙酮酸催化形成牛磺乙酸的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和将草酰乙酸转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶。梭状芽孢杆菌以丙烯酰辅酶A为前体可以通过丙烯酸酯途径来形成丙酸[16]。最后，还可由脱氧糖如鼠李糖从二羟基丙酮磷酸或乳酸产生1,2-丙二醇，它可以进一步代谢为丙酸盐或丙醇[17]。丁基辅酶A可以通过两种不同的途径生成丁酸。以粪球菌为代表，利用磷酸转丁基酶产生丁基磷酸，通过丁酸激酶的作用产生丁酸[18]。第二种机制涉及到乙酸辅酶A转移酶，利用乙酸作为底物转化为丁酸[19]。DUNCAN等[20]在体外培养研究发现，分离自人粪样的74株产丁酸菌中50%需要消耗乙酸产生丁酸，表明他们都是利用丁酰辅酶A和乙酰辅酶A转移酶来形成丁酸。BOTTA等[21]研究表明植物乳杆菌S2T10D可以通过底物谷氨酰胺生成丁酸。当谷氨酰胺含量从2 mmol/L增加到6 mmol/L时，乳杆菌O2T60C的代谢活动减缓，同时，植物乳杆菌S2T10D诱导产生大量丁酸。

2 益生菌以短链脂肪酸为功效成分而发挥的功能

2.1 缓解炎症性肠病

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBDs)其典型症状包括腹痛、腹泻、便血、食欲不振、乏力和体重减轻[22]。一些益生菌菌株已被证实可以改善高血压、肥胖、炎症、葡萄糖稳态紊乱和血脂水平异常等代谢疾病，其中SCFAs可作为活性成分而有效改善部分疾病症状[6]。肠道是SCFAs介导肠上皮完整性或黏膜免疫反应的主要部位。导致SCFAs减少的肠道菌群紊乱与包括IBD在内的结肠疾病有关。SCFAs通过调节免疫细胞趋化性、活性氧(reactive oxygen，ROS)释放以及细胞因子释放发挥抗炎功能。丁酸盐通过抑制IL-12和上调人单核细胞中IL-10的产生，抑制促炎分子TNF-α、IL-1b和NO的产生，并降低NF-κB的活性。

肠道菌群在调节肠道稳态和炎症性肠病的发病机制中的作用已得到公认。SCFAs由肠道细菌，从其他不消化的富含纤维的饮食中代谢，已被证明可以改善IBD和过敏性哮喘动物模型的疾病。OHARA等[23]给10个结肠癌患者和20个健康成人接受格氏乳杆菌LG21治疗12周，结果表明给药后体内肠道中乳酸菌含量上升，产气荚膜梭菌数量下降，并且粪便中丁酸浓度和自然杀伤细胞活性显著上升。FUKUDA等[24]使用了灌胃7 d双歧杆菌的小鼠和肠出血性大肠杆菌O157∶H7致死感染的简化模型，研究发现双歧杆菌有助于保护小鼠免受大肠杆菌O157∶H7诱导的死亡，并且灌胃双歧杆菌的小鼠乙酸含量明显高于非灌胃的小鼠，结果表明粪便乙酸含量与小鼠对大肠杆菌O157感染的抗性呈正相关。通过向无菌小鼠的饮用水中添加右旋糖酐硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS)的化学方法诱导结肠炎。与常规饲养小鼠相比，这些小鼠体内细菌的缺失及其对免疫反应的影响导致了严重的结肠炎症。在饮用水中加入150 mmol/L乙酸处理小鼠，可显著改善疾病指数，增加结肠长度，降低疾病活动指数(disease activity index,DAI)和炎症介质髓过氧化物酶(mediomedullperoxidase，MPO)水平，并降低TNF-α和炎症MIP1a(也称为CCL3)水平[25]。从临床健康断奶仔猪的结肠内容物中筛选出具有潜在益生特性的乳酸菌菌株，并通过菌株耐酸和体外黏附能力从体外分离出具有较高代谢产物如丁酸，乙酸和乳酸的约氏乳杆菌L531，发现L531中的SCFAs可以防止婴儿链球菌感染引起的肠道代谢稳态破坏，并增强宿主对微生物器官的控制能力，防止其被沙门氏菌感染破坏[26]。因此，使SCFAs水平正常化以及修复失调可能对IBD的治疗具有协同和有益的作用。

2.2 缓解糖尿病

糖尿病患者具有肠道微生物组改变的特点，可导致肥胖、代谢性内毒素血症、B细胞功能障碍、全身性炎症和与疾病相关的氧化应激[27]。SCFAs在控制葡萄糖稳态中的作用可能是由于它们参与了葡萄糖合成。研究表明，在饮食中添加阿拉伯木聚糖可以通过增加血浆SCFAs浓度来改善Ⅱ型糖尿病患者的糖耐量。简而言之，SCFAs控制葡萄糖稳态的机制是SCFAs可以通过与细胞膜上的FFAR2受体结合，直接刺激结肠杯状细胞(分泌细胞)分泌胰高血糖素样肽(glucagaon-like ppeptide-1,GLP-1)。也有报道显示，丙酸通过游离脂肪酸受体激活GLP-1介导的神经网络，从而调节回肠细胞参与糖稳态，这表明在饮食中添加SCFAs可能直接提高糖耐量。

研究表明，某些益生菌如双歧杆菌在人和动物实验中都能分泌胰岛素类似物，促进靶脂肪细胞的预期生物学效应[28]。越来越多的证据表明，补充益生菌和益生元可降低血清总胆固醇、低密度脂蛋白和炎症，从而对心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)具有预防和治疗作用。EJTAHED等[29]研究益生菌和传统酸奶对2型糖尿病患者血脂水平的影响。通过随机双盲对照试验，将60例2型糖尿病患者分为两组，分别每天饮用300 g含有嗜酸乳杆菌La5和乳酸双歧杆菌Bb12的益生菌酸奶或300 g常规酸奶，持续6周。食用益生菌酸奶可使总胆固醇降低4.54%，低密度脂蛋白降低7.45%。并且动脉粥样硬化指标显著降低。益生菌酸奶可改善2型糖尿病(diabetes mellitus type 2,T2DM)患者的总胆固醇和低密度脂蛋白浓度，并可能有助于改善心血管疾病的危险因素。由于T2DM肠道菌群失衡，容易导致SCFAs的产生减少。益生菌治疗由于肠道细菌产生的SCFAs的增加以及其他功能，可能对治疗糖尿病有效。WANG等[30]为了探讨植物乳杆菌、乳球菌、副干酪乳杆菌等14种益生菌可能的抗糖尿病机制。对60只小鼠随机分为模型组和不同浓度的益生菌组，通过6周的实验结果发现，所测益生菌可改善血糖和血脂指标，导致T2DM发育延迟。这些益生菌还通过提高SCFAs(丙酸和丁酸)的水平以及cluaudin-1和mucin-2的表达来改善肠道菌群的功能并降低大肠杆菌和脂多糖水平。此外益生菌通过上调G蛋白偶联受体43/41、原胰高血糖素和转化酶1/3的活性显著促进胰高血糖素样肽-1的分泌。这些研究的结果表明，14种复合益生菌可能被认为是治疗T2DM患者的潜在治疗方法。TONUCCI等[31]旨在研究益生菌对T2DM血糖控制、脂质和SCFAs的影响，对50名志愿者每天摄入120 g/d的发酵牛奶，持续6周。实验分为益生菌组(含嗜酸乳杆菌La-5和动物双歧杆菌BB-12发酵乳)和对照组(含常规发酵乳)。6周后，益生菌组粪便中乙酸水平显著下降至0.58%(质量分数)。益生菌组的糖化血脂蛋白(HbA1c)下降0.65%，并且总胆固醇和低密度脂蛋白分别下降0.15、0.2 mmol/L。这些结果表明益生菌的摄入改善了T2DM受试者的血糖控制，发酵牛奶的摄入可以使乙酸含量增加。

2.3 防止过度肥胖

肥胖是心血管疾病、血脂异常、肝胆疾病、糖尿病、过早死亡和几种癌症的危险因素[32]。据估计，世界上有17亿人超重。肥胖个体的肠道菌群组成通常会发生改变，这表明肠道菌群可以被认为是导致肥胖发生的因素。在适当的饮食中使用益生菌控制微生物种群可以减少肠炎，改善肠道屏障的完整性，增加有益细菌的数量，从而导致体重减轻[33]。有证据表明，在脂肪组织中，SCFAs与G蛋白偶联受体43结合，抑制脂肪积累，从而减少脂肪酸摄入量。此外，GPR43的激活促进了线粒体的生物发生，增加了细胞利用能量产生热量的能力。这是由于SCFAs与肠细胞表面受体GPR41/43作用，促进肠道激素分泌，这些激素可以调节胃肠道运动和分泌，改变肠壁通透性，减少胃肠道从食物中吸收能量。

很多研究表明，使用益生菌可以改善动物以及人类的肠道失调和肥胖[34]。MCINTOSH等[35]研究调查了补充鼠李糖乳杆菌CGMCC1.3724(LPR)对肥胖男性和女性24周体重减轻和维持的影响。实验证明LPR益生菌组女性的平均体重下降显著高于安慰剂组，而在两组男性中相似。与此同时，与肥胖相关的肠道菌群变化可能导致SCFAs的产生减少。HUANG等[36]研究了豆蔻中植物乳杆菌对异常碳水化合物的改善作用评价高脂饮食(high fat diet，HFD)诱导的大鼠代谢，其中模型组喂食高脂饲料，治疗组在高脂饲料的基础上，喂食植物乳杆菌发酵的豆蔻[40 mg/(kg·d)]，口服4周后大鼠粪便中乙酸含量从4.16 mg/kg显著提升至7.86 mg/kg，丙酸和戊酸含量也有显著提升，结果表明植物乳杆菌在大豆中共培养增加大鼠肠道SCFAs释放。在另一项研究中，调查40名学龄儿童(19名正常体重儿童和21名超重儿童)饮用益生菌后的肠道菌群变化。受试者被分为正常体重组和超重体重组，并进一步分为干预组和对照组。这些儿童饮用含有干酪乳杆菌Shirota菌株的益生菌饮料4周。研究发现，饮用益生菌饮料导致超重儿童肠道菌群中乳酸菌和双歧杆菌数量显著增加。在正常体重和超重的儿童补充4周后，观察到两组的SCFAs浓度都显著增加，特别是丙酸。此外，超重儿童粪便中SCFAs的浓度(特别是丁酸和丙酸)高于正常体重儿童[37]。NAGATA等[38]研究了34名儿童的肠道菌群变化，其中包括正常体重22名和肥胖体重12名。研究发现肥胖组接受了饮食和运动治疗6个月后每天饮用含有干酪乳杆菌Shirota饮料，体重显著下降，并且高密度脂蛋白水平显著上升。此外，粪便中双歧杆菌的浓度显著增加从1×107cells/g增长至1×109cells/g，乙酸浓度从摄入前的45 μmol/g明显升高至摄入后的57 μmol/g。结果表明干酪乳杆菌Shirota有助于减轻体重，同时也改善肥胖儿童的脂质代谢。

2.4 抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡

SCFAs除了在免疫、炎症和代谢中发挥重要作用外，还影响肿瘤细胞的增殖和凋亡。在牛肾上皮细胞体外培养中，因为丁酸盐影响有丝分裂G1的早期阶段，当添加10 mmol/L丁酸盐引起细胞周期阻滞和细胞生长抑制。SCFAs(主要是丁酸和丙酸)的治疗可以抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

CHEN等[12]在人类结肠癌细胞系HCT116、SW1116和Caco-2的研究中，分析了丁酸梭菌23857和枯草芽孢杆菌19398的作用和机制，由于条件培养基中存在杆菌肽或丁酸，导致细胞周期停滞和凋亡激活，从而减少了细胞增殖和炎症基因的表达。YUSUF等[39]探讨与非结直肠癌(colorectal cancer，CRC)患者相比，CRC患者的微生物菌群结构与SCFAs水平之间的关系。分别对14名CRC受试者和14名非CRC受试者进行研究，用气相色谱法对他们的粪便样本进行SCFAs分析，并使用16S rRNA基因变性梯度凝胶电泳(denaturing gel gradient electrophoresis，DDGE)探索细菌的多样性。分析显示与非CRC患者相比，CRC患者粪便中双歧杆菌数量减少，所有结直肠癌受试者的双歧杆菌显性谱带均消失。乙酸、丙酸和丁酸的浓度显著降低，平均下降到8.55 μg/mL，丙酸为5.61 μg/mL，丁酸为3.79 μg/mL。

2.5 CVD

心血管疾病是当今世界发病和死亡的主要原因，目前正在寻找治疗血胆固醇升高的方法。研究表明，含有乳酸菌的发酵牛奶可以降低胆固醇。一些乳酸菌，主要是乳酸菌和双歧杆菌，能够调节高胆固醇血症。体外研究和动物模型也被用来确定益生菌干预对代谢过程和与胆固醇调节相关的基因表达的影响[40]。此外，益生菌还能直接吸收胆固醇，干扰肠道对胆固醇的吸收。已有研究表明，乳酸菌发酵食物来源的不消化碳水化合物，在肠道中产生SCFAs，然后通过抑制肝脏胆固醇合成或通过将胆固醇从血浆重新分配到肝脏，从而导致全身血脂水平下降。并且SCFAs具有调节心血管疾病危险因素的能力，包括降低血压和调节糖脂稳态。一项研究对小鼠进行高胆固醇血症的造模实验，高胆固醇血症小鼠的饮用水中补充了乳酸菌和双歧杆菌混合益生菌，持续了8周，并与对照组小鼠进行了对比，前者给予低脂肪饮食或未补充的高脂肪饮食。结果，在一个小鼠模型中发现，益生菌补充剂增加了结肠反应器中丙酸的微生物生成，同时降低了有害的低密度脂蛋白和高密度脂蛋白水平。另一项研究旨在测定发酵乳杆菌296对高脂饮食诱导的大鼠心脏代谢紊乱的益生菌作用[41]。大鼠灌胃益生菌4周发现，乳酸杆菌296能够改善心脏代谢紊乱患者的心血管和生化参数。SCFAs的增加调节血管舒张和诱导低血压被认为是这种益生菌可能的作用机制。

3 展望

目前已对SCFAs的特点、在肠道和益生菌中的分布作了比较系统的研究，对其合成途径也有了更加全面的了解。并且有大量研究表明，益生菌中的SCFAs 在维持人体肠道和免疫稳态方面发挥着非常重要的作用，如结肠炎、肠易激综合征、2型糖尿病、肥胖症或癌症等。鉴于SCFAs在免疫和炎症中的突出作用，补充SCFAs可能是未来预防甚至治疗炎症和免疫相关疾病的一种有效策略。近年来随着分子生物学等技术不断成熟，国内外对SCFAs的研究也越来越深入。为了更好地了解SCFAs的功能，以后需要对益生菌中产生SCFAs的基因，蛋白表达和遗传方面做更进一步的判辨，更有力的缩小范围并确定SCFAs在益生菌中发挥的潜力和作用，也为产生SCFAs的益生菌在食品及药品保健品中的应用奠定更完善的理论基础。在此基础上，还需要研究利用基因编辑技术，如CRISPER/Cas9更加专业、精准地构建SCFAs产量高的益生菌，通过干预饮食或保健品的方法来控制本综述所述的疾病，这对SCFAs作为临床工具具有长远的意义。