超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱法检测白酒中甜味剂

倪小龙，吴金凯，陆雪梅，梅 婕，张温清，周 萍

（1.宣城市食品药品检验中心，安徽宣城 242000；2.安徽宣酒集团股份有限公司科研技术中心，安徽宣城 242000）

白酒，中国传统的文化饮品，是老百姓餐桌上不可或缺的一部分，每年的生产量、消费量都很大，因此白酒也是日常监督抽检重点食品之一。白酒在异常发酵酿造的过程中会产生一些苦味物质，影响口感，而部分小作坊为了掩盖此缺陷违规添加甜味剂，以次充好，因此历年来国家或省地区白酒抽检中，甜味剂检出屡见不鲜[1]。《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）[2]中对甜味剂的使用有着严格的规定，纯粮固态发酵的白酒中不允许添加，因此检测白酒中甜味剂对白酒质量日常监管和自身企业质量控制都有重大意义。现阶段白酒甜味剂检测国标方法多为单一种类检测，如《食品安全国家标准 食品中环己基氨基磺酸钠的测定》（GB 5009.97—2016）[3]采用的是超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用法，而在实际检测中发现，该方法在低浓度检测时存在基质干扰，且其采用的是正负离子同时扫描，正离子响应较低，不能准确定性，容易出现漏判、误判。三氯蔗糖目前按照《食品安全国家标准 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的测定》（GB 22255—2014）[4]检测，但因其检测灵敏度太低，在低浓度范围，该方法无法使用。出入境检验标准《出口食品中六种合成甜味剂的检测方法 液相色谱-质谱/质谱法》（SN/T 3538—2013）[5]采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用法同时检测6 种甜味剂，但其检测范围不包含白酒，而且甜蜜素也只提供一个离子对，不符合质谱检测定性要求等问题。爱得万甜、麦芽糖醇目前尚未见白酒中的国标检测方法。本研究旨在使用超高效液相色谱三重四极杆与离子阱联用（Ultra Performance Liquid Chromatography-Triple Quadrupole Composite Linear Ion Trap Mass Spectrometry，UPLC-QTRAP）技术一步法同时检测白酒中安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜、纽甜、阿力甜、三氯蔗糖、麦芽糖醇及爱得万甜9 种常见甜味剂，在保证定量准确性的同时，减少检测假阳性率，为白酒监管以及白酒质量控制提供有效技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甜蜜素、糖精钠、安赛蜜、阿力甜、纽甜、阿斯巴甜液体标准品，购自于北京坛墨质检标准品有限公司；麦芽糖醇（纯度99.0%）、三氯蔗糖（纯度99.7%）、爱德万甜（纯度99.7%）固体标准品，购自于上海安谱有限公司；乙腈、甲醇、甲酸、乙酸铵，均为HPLC 级，购自于上海安谱有限公司。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱-三重四极杆线性复合离子阱 质 谱 仪AB 5500QTRAP， 美 国SCIEX 公 司；phenomenex kinetex F5（100 mm×3.0 mm，2.6 μm）、phenomenex kinetex C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），美国菲罗门公司；电热恒温水浴锅XMTD-400，上海科恒实业发展有限公司；电子天平AL204，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；Millipore 超纯水机，美国Millipore 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液配制

准确称取50.0 mg固体标准品，分别用50%甲醇-水溶解定容至50 mL，得到浓度为1.0 mg/mL 单标储备母液。取每种单标储备母液0.5 mL，用50%甲醇-水稀释定容至50 mL，得到浓度为10.0 μg/mL 混标中间液，于≤5 ℃避光保存。系列混合标准工作液（0.025 ～1.000 μg/mL）使用50%甲醇-水连续稀释得到，现用现配。

1.3.2 样品前处理

准确称取白酒样品5.0 g 置于烧杯中，于80 ℃水浴加热20 min，残渣全部转至50 mL 容量瓶中，用水定容并摇匀，经0.22 μm 水相微孔滤膜过滤于样品瓶中，上机测试。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：phenomenex kjnetex F5，柱温45 ℃，流动相：A 流动相为0.1%甲酸-5 mmol/L 乙酸铵水溶液，B 流动相为乙腈，流速为0.4 mL/min，二元高压模式。进样量5 μL，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.3.4 质谱条件

离子源：TurboV 电喷雾离子源（Electron Spray Ionization，ESI）负离子扫描；雾化气（Gas1/Gas2）：50/50 Psi；离子化温度：500 ℃；离子喷雾电压（Ion Spray，IS）：-4 500 V；气帘气（Curtain Gas，CUR）：35 Psi；扫描模式：多反应监测-信息关联采集-增强子离子（多反应监测-信息关联采集-增强子离子（Multi Reaction Monitoring-Information Dependent Acquisition-Enhancer Ion，MRM-IDA-EPI）。 化 合物摄入电压：-10 eV；碰撞室射出电压：-16 eV；碰撞模式：HIGH；碰撞气：氮气。IDA：峰阈值为1 600 cps。EPI：碰撞能量（Collision Energy，CE）为-35 eV，碰撞能量扩展（Collision Energy Spread，CES）为15 eV。使用SCIEX OS 1.7 软件对仪器进行控制采集以及数据分析。

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

用1.0 μg/mL 混标溶液进样，依据各化合物的分子质量，使用Q1 扫描模式确定ESI 负离子模式下准分子离子峰即确定母离子质荷比；选择所确定的母离子，用二级子离子模式扫描，确定离子碎片信息，选定2 对响应最强的特征离子作为定性离子，以响应值最大碎片离子为定量离子，用MRM 模式，得到最优的CE 和DP 值，初步建立质谱分析方法，优化结果见表2。

经过优化得到9 种化合物的质谱参数，包括保留时间、定性定量离子对、去簇电压（Declustering Potential，DP）及碰撞能量（Collision Energy，CE），如表2 所示。

表2 9 种甜味剂的保留时间和质谱参数

2.2 色谱条件优化

由于需采用MRM-IDA-EPI 模式进行采集，质谱扫描驻留时间仅8 ms，所以超高效液相色谱需要得到良好的色谱峰形，以满足分析要求。实验对比了phenomenex kinetex F5、phenomenex kinetex C182款色谱柱，2 款色谱柱均能实现白酒中9 种甜味剂的分离，但在浓度为25 ng/mL 时，phenomenex kinetex F5 色谱柱得到的S/N值更高，故选用此款色谱柱，如表3 所示。

表3 25 ng/mL 混标不同色谱柱S/N 值比较结果

2.3 EPI 普库的建立

通常超高效液相色谱三重四极杆质谱的MRM模式是通过定性离子对的保留时间、质荷比、相对丰度比进行定性。UPLC-QTARP 的MRM-IDA-EPI扫描方式，不仅可以使用MRM 定性模式，还增加了二级谱库的匹配用于定性分析，由于离子阱的富集功能，在低浓度时可以有效提高离子响应值，从而降低结果的假阳性率。该方法在MRM 分析的基础上，以预定义的信息关联采集标准自动触发增强子离子二级质谱扫描，其离子阱富集功能可获得高灵敏度的二级质谱信息。利用混合标准品溶液，通过MRM-IDA-EPI 模式采集在-20 eV、-35 eV、-50 eV 3 中碰撞能量下的质谱图，建立可搜索EPI 二级谱库。将样品分析时获得的EPI 二级谱图与谱库进行匹配搜索，通过正向和反向匹配的得分值判断是否为目标物，得分越高则定性结果的准确度越高。如在实际检测中，对含1 ng/mL 甜蜜素的白酒样品，用EPIP 谱图库搜索匹配分仍有80 分。该方法通过一次进样同时满足了高灵敏度的定量分析和基于谱库的定性检测需求。9 种化合物质量色谱图谱图见图1，1 ng/mL 甜蜜素样品提取离子谱图见图2，1 ng/mL甜蜜素样品EPI 谱图搜索结果见表4。

表4 1 ng/mL 甜蜜素EPI 谱图搜索结果

图1 9 种甜味剂质量色谱图

图2 1 ng/mL 甜蜜素提取离子谱图

2.4 方法学验证

2.4.1 线性范围、检出限和定量限

使用50%甲醇-水配制混合标准工作液25 ～1 000 ng/mL，过0.22 μm 水相微孔滤膜过滤上机，以定量离子的峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。9 种甜味剂线性关系良好，相关系数R均大于0.995。按照信噪比（S/N）=3和S/N=10 计算方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ），检出限（LOD）分别在0.001 ～0.048 mg/kg，定量限（LOQ）为0.004 ～0.160 mg/kg。具体详见表5。

表5 9 种甜味剂线性方程、相关系数、检出限、定量限

2.4.2 回收率和精密度

选取未检出甜味剂的白酒作为本底，进行3 种浓度水平0.25 mg/kg、0.50 mg/kg、1.00 mg/kg 的添加实验，重复测定6 次。结果如表6 所示，样品平均加标回收率为80.9%～110.1%，RSD 为3.78%～11.80%，均满足样品痕量检测要求。

表6 白酒中9 种甜味添加回收率和精密度（n=6）

2.5 市售白酒样品的测定

按照上述优化、建立的白酒9 种甜味剂测试方法，于市场上随机选取了酱香型白酒、清香型白酒、浓香型白酒、浓香型、凤香型、清香型、稻谷香型、兼香型及小作坊自酿纯粮酒等40 个样品进行检测分析，其中甜蜜素检出3 份，浓度分别为0.025 mg/kg、0.013 mg/kg、0.260 mg/kg，三氯蔗糖检出1 份，浓度为0.96 mg/kg，其余均为未检出。

（续表6）

3 结论

本研究建立了UPLC-QTARP 方法同时检测白酒9 种甜味剂的方法，本方法前处理简单、快速、灵敏度高、在低浓度时判定阳性可靠度高，适用于白酒中安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜、纽甜、阿力甜、三氯蔗糖、爱得万甜及麦芽糖醇的检测。