HPLC法同时测定莱阳梨止咳颗粒、糖浆中的盐酸麻黄碱、绿原酸、苯甲酸的含量

任菲菲，刘德丽，马斐，闫雪，郑艳青

(德州市食品药品检验检测中心，山东 德州 253000)

莱阳梨为蔷薇科植物白梨(PyrusbretschneideriRehd.)的栽培变种茌梨的新鲜果实，是山东地理标志品牌，入选中国地理标志注册名录，也是国内唯一入药并以此命名的梨果[1]。曾被列为皇家贡品，名驰南北[2]。由莱阳梨制成的清膏添加麻黄提取液、杏仁水、百合流浸膏、远志流浸膏、北沙参流浸膏、薄荷脑等制成的莱阳梨止咳颗粒、糖浆收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第十四册。可镇咳祛痰，用于伤风感冒引起的咳嗽多痰，急、慢性气管炎[3]。莱阳梨中的绿原酸具有抗菌作用[4]，麻黄中盐酸麻黄碱具镇咳作用[5-8]，而苯甲酸为常用防腐剂，近年来研究表明，其毒副作用不容小视，长期过量服用会致癌、具有细胞毒性、精子畸形及轻度蓄积作用[9-10]。针对目前莱阳梨止咳颗粒、糖浆相关研究较少，质量标准相对落后的问题，为确保制剂质量，拟采用高效液相色谱法对其中绿原酸、盐酸麻黄碱和苯甲酸等3种成分进行测定。

1 仪器和试药

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪；Milli-Q Integral3 超纯水系统；Mettler Toledo ML204电子分析天平。

1.2 试药 乙腈、甲醇为色谱纯(上海科密欧高纯试剂有限公司)；磷酸为分析纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)；水为超纯水。

1.3 对照品 盐酸麻黄碱对照品(批号：171241-201508，含量：99.8%)；绿原酸对照品(批号：110753-201716，含量：99.3%)；苯甲酸对照品(批号：100419-200301，含量：100.0%)；以上对照品均由中国食品药品检定研究院提供。

1.4 材料 莱阳梨止咳糖浆、颗粒共34批样品，均为药品监督管理部门在山东省各药品生产企业、经营企业、医疗单位抽样样品(见表 1)。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.4%磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱条件见表2，柱温：30 ℃；检测波长：0～20 min(210 nm)；20～45 min(327 nm)；45～52 min(230 nm)；进样量：10 μL,样品中各个峰得到很好的分离。

表2 梯度洗脱表

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取盐酸麻黄碱、绿原酸、苯甲酸对照品适量，精密称定，加甲醇溶解稀释制成每1 mL中约含盐酸麻黄碱60 μg、绿原酸12 μg、苯甲酸1 mg的混合对照品溶液，即得。

2.2.2 供试品的制备 莱阳梨止咳糖浆：精密量取本品5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。

莱阳梨止咳颗粒：取装量差异项下的本品，研细，取约5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率300 W，频率45 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按照《卫生部药品标准》中药成方制剂第四册中莱阳梨止咳颗粒、糖浆标准中规定的处方工艺，制成不含莱阳梨清膏、麻黄提取液的阴性样品。按“2.2.2”项下制备阴性样品溶液。

2.4 系统适用性试验 取混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，结果理论塔板数以各对照品峰计均大于6 500，分离度均大于1.5。

2.5 线性关系的考察 精密吸取盐酸麻黄碱对照品溶液(62.225 3 μg·mL-1)1、2、4、6、8、10 μL；绿原酸对照品溶液(11.588 3 μg·mL-1)1、2、4、6、8、10 μL；苯甲酸对照品溶液(212.3 μg·mL-1)1、5、10、15、20、25 μL(230 nm)；苯甲酸对照品溶液(1 061.5 μg·mL-1)1、2、3、4、5、6 μL(248 nm)下分别进样，按“2.1”项下色谱条件测定，以对照品进样量(μg)为横坐标(X)，以对照品峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，回归方程分别为：Y= 2 142.6X-11.954(r=0.999 9)；Y= 3 117.9X-0.687 4(r=1.000 0)；Y=5 278X+42.335(r=1.000 0)；Y=3 203.5X-2 854.8(r=0.999 9)。

A.混合对照品；B.莱阳梨止咳颗粒；C.莱阳梨止咳糖浆；D.莱阳梨止咳颗粒阴性样品；E.莱阳梨止咳糖浆阴性样品 1.盐酸麻黄碱；2.绿原酸；3.苯甲酸图1 高效液相色谱图

表明盐酸麻黄碱对照品溶液、绿原酸对照品溶液、苯甲酸对照品溶液分别在0.062 23～0.622 3、0.011 59～0.115 9、0.212 3～5.307 51(莱阳梨止咳颗粒)、1.061 5～6.369 0(莱阳梨止咳口服液)μg的进样量范围内均与其峰面积呈良好的线性关系。

2.6 精密度试验 取上述混合对照品溶液，连续进样5次，结果表明，盐酸麻黄碱的保留时间RSD<0.3%，峰面积RSD<0.2%；绿原酸的保留时间RSD<0.4%，峰面积RSD<0.3%；苯甲酸的保留时间RSD<0.4%，峰面积RSD<0.5%，表明该方法重复性良好。

2.7 重复性试验 取编号为A1莱阳梨止咳颗粒样品，平行制备6份，分别进样，求得各样品中盐酸麻黄碱的含量，平均值为0.148 6 mg·g-1，RSD<1.0%；绿原酸的含量，平均值为0.009 9 mg·g-1，RSD<0.9%；苯甲酸平均值为0.282 36 mg·g-1，RSD<1.3%；表明该方法重复性良好。取编号为S14的莱阳梨止咳糖浆供试品，平行制备6份，分别进样，求得各样品中盐酸麻黄碱的含量，平均值为0.099 9 mg·g-1，RSD<0.8%；绿原酸的含量，平均值为0.357 1 mg·g-1，RSD<0.5%；苯甲酸平均值为0.063 6 mg·g-1，RSD<1.2%；表明该方法重复性良好。

2.8 稳定性试验 取编号为A1的莱阳梨止咳颗粒和编号为S14的莱阳梨止咳糖浆供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12 h进样测定，记录色谱图，其盐酸麻黄碱、绿原酸和苯甲酸峰面积RSD分别为1.2%、1.4%、2.1%和1.5%、1.7%、2.0%，试验结果表明莱阳梨止咳颗粒和莱阳梨止咳糖浆的供试品溶液在12 h内稳定。

2.9 回收率试验 莱阳梨止咳颗粒：经计算，编号为A1的样品中盐酸麻黄碱、绿原酸、苯甲酸的含量分别为0.148 6、0.009 9、0.282 3 mg·g-1。取本品研细，平行6份，取约2.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入含盐酸麻黄碱对照品0.033 08 mg·mL-1，绿原酸对照品0.002 816 mg和苯甲酸0.080 23 mg混合对照品溶液10 mL，精密加入50%甲醇10 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率300 W，频率45 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

莱阳梨止咳糖浆：经计算，编号为S15的样品中盐酸麻黄碱、绿原酸、苯甲酸的含量分别为0.169 4、0.013 2、1.071 2 mg·mL-1。精密量取本品5 mL，置10 mL量瓶中，平行6份，分别精密加入盐酸麻黄碱对照品0.330 8 mg，绿原酸对照品0.028 16 mg和苯甲酸2.793 2 mg，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。

取上述两种供试品溶液，分别按上述“2.1”项下色谱条件测定，计算回收率。结果见表3～4，表明本方法具有良好的回收率。

表3 莱阳梨止咳颗粒加样回收率试验结果(n=6)

表4 莱阳梨止咳糖浆加样回收率试验结果(n=6)

2.10 样品测定 取10批莱阳梨止咳颗粒和30批莱阳梨止咳糖浆，按“2.2.2”项下的方法制备样品，并按“2.1”项下色谱条件进样检测，采用标准曲线计算样品中3种成分的含量，结果见表5。

表5 样品含量测定结果[n=10,mg·g-1(莱阳梨止咳颗粒)；n=30,mg·mL-1(莱阳梨止咳糖浆)]

3 讨论

3.1 检测波长的选择 提取对照品色谱中各色谱峰在190～400 nm范围的吸收光谱，显示盐酸麻黄碱在210 nm处有强吸收，绿原酸在327 nm[11]有强吸收，苯甲酸在230 nm处有强吸收。参考相关文献[12-14]，同时结合目标峰响应强、分离度好、杂质峰干扰小等因素，选用0～20 min(210 nm)，20～45min(327 nm)，45 min以后230 nm的波长转换方法作为本文方法。

3.2 提取条件的考察 以糖浆剂为试验样品，分别考察了使用乙酸乙酯进行萃取、以乙醇为溶剂超声并离心、以甲醇为溶剂直接溶解提取等不同的提取方式，对提取过程的难易及结果的准确度进行了分析，最终确定了本方案的提取方法为：精密量取本品5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。因莱阳梨止咳颗粒与糖浆剂处方相同，因此参考糖浆剂的提取方法，确定方法为：取本品5 g,研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率300 W，频率45 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.3 样品数据分析 莱阳梨止咳颗粒共检测了2个厂家的10批样品，均检出盐酸麻黄碱和绿原酸，同时检出了苯甲酸，结合生产工艺，并且通过对颗粒中原料莱阳梨清膏中的苯甲酸进行了测定，可知苯甲酸来自于莱阳梨清膏。莱阳梨止咳糖浆共检测了3个厂家的30批样品，其中S30号样品中未检出绿原酸，盐酸麻黄碱含量也远低于其他厂家的样品，怀疑可能存在未投料或少投料的现象，但该厂家样品仅有此1批，还需进行更多样品的研究。其余各厂家糖浆剂中均检出了盐酸麻黄碱和绿原酸。

根据表5中的检测结果，将莱阳梨止咳颗粒和糖浆的含量测定限度拟订为：含麻黄提取液以盐酸麻黄碱计不得少0.15 mg·g-1；含莱阳梨以绿原酸计不得少0.017 mg·g-1；《中国药典》2015年版(四部)通则“糖浆剂”项下规定：“苯甲酸的用量不得过0.3%(其钾盐、钠盐的用量分别按酸计)”，但没有制定相应的含量测定方法。采用本文建立的检测方法，测定结果显示莱阳梨止咳颗粒和糖浆中苯甲酸的含量均符合药典规定。

3.4 小结 本试验采用HPLC法，对莱阳梨止咳颗粒、糖浆中的盐酸麻黄碱、绿原酸、苯甲酸同时测定，样品处理简单，方法准确可靠，可为莱阳梨止咳颗粒、糖浆的质量标准修订提高提供参考。