羊水染色体核型分析联合基因芯片在高危孕妇产前染色体畸变筛查中的应用

易巧兰 陈小东 梁荣坤 钟羽彤

1 福建医科大学附属龙岩第一医院检验科，福建省龙岩市 364000；2 福建省龙岩市疾病预防控制中心检验科

染色体畸形是威胁人类生育质量的先天性遗传性疾病，目前医学界尚无有效的预防手段。因此，产前筛查及诊断染色体疾病，减少出生缺陷越来越受到重视。目前，羊水染色体核型分析是产前诊断染色体畸变的主要方法，可检测出胎儿染色体数目与结构的异常，但该技术分辨率较低，对<5～10bp的染色体异常较难检查，存在漏检染色体微缺失或微重复状况，且羊水染色体核型分析一般2周时间才可得到结果，不适宜在危重症产妇中开展[1-2]。基因芯片是建立在基因探针和杂交测序技术上的一种高效快速的核酸序列分析技术，可检出染色体的微缺失与微重复，弥补羊水染色体核型分析的不足[3-4]。目前，临床比较两种技术筛查孕妇产前染色体畸变的对比研究较多，而联合筛查的研究相对较少。鉴于此，本研究旨在分析羊水染色体核型分析联合基因芯片在高危孕妇产前染色体畸变筛查中的价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究经医学伦理委员会审核批准，选取2021年2—10月于福建医科大学附属龙岩第一医院门诊进行产前染色体畸变筛查的125例疑似高危产妇为研究对象，产妇及家属均签署知情同意书。纳入标准：(1)单胎妊娠、活胎；(2)于医院建立产检卡，且定期进行产检；(3)于医院接受羊水染色体核型、基因芯片检查。排除标准：(1)具有先兆流产倾向；(2)有出血倾向(血小板≤70×109/L，凝血功能检查异常)；(3)伴有盆腔或宫腔感染；(4)非自然妊娠；(5)体温>37.2℃。125例孕妇年龄24～46岁，中位年龄[35.00(31.00，38.00)]岁；筛查时孕周16～28周，中位孕周[22.00(21.00，22.00)]周；孕次1～3次，中位孕次[2.00(2.00，3.00)]次；B超检查异常21例，不良孕产史8例，血清筛查高危20例，颈部透明层(Nuchal translucency，NT)增厚14例，高龄孕妇62例。

1.2 方法

1.2.1 标本取材：孕妇及家属均签署羊水穿刺知情同意书，于孕16～28周在超声(GE Ultrasound Korea, Ltd，国械注进20152232990，型号：LOGIQ P9)引导下抽取羊水30ml左右，具体方法：孕妇排空膀胱，取仰卧位，通过B超观察胎盘位置、羊水量，确定穿刺点(需避开胎盘，寻找最大又紧贴腹壁的羊水池)；腹部消毒铺巾，在无菌操作下，采用一次性腰穿针抽取羊水30ml，放入3个无菌管中。

1.2.2 羊水染色体核型分析：将2支无菌管，以1 500r/min速率离心10min，吸去上层清液，取下层沉淀，分别接种于5ml的羊水培养基中并混匀；分别放置在37℃、5%CO2的培养箱内，第7天后通过奥林巴斯YMPUS CKX4倒置显微镜观察羊水细胞生长情况，若出现多个细胞集落生长进行换液再次培养；第9天时再次观察生长情况，若细胞背景层出现折光性较强的圆形细胞>8个则表示生长状况理想，加入100μg/ml秋水仙素2滴，4h后行细胞收获、制片，并行常规染色体G显带，扫片后分析5个，计数20，参照《染色体核型检验诊断报告模式专家共识》[5]对染色体核型进行分析。

1.2.3 基因芯片：将基因芯片送至北京贝康医学检验所进行检查，具体方法：将另1个10ml的羊水标本以1 700r/min速率离心10min，弃上清，取沉淀物，采用核酸提取试剂盒提取羊水基因组DNA，保存于-20℃环境中，采用核酸蛋白分析仪(贝克曼库尔特，IMMAGE 800型)测定DNA的浓度与纯度，要求基因组DNA浓度>25μg/μl。(1)消化：将5μl全基因组DNA采用NspⅠ酶随机消化为短片段；(2)连接：将消化后产物末端补齐后连接上共同引物；(3)PCR扩增：将上述处理后样本扩增至150～2 000bp片段；(4)PCR产物纯化：将扩增的产物采用磁珠法进行纯化；(5)片段化：通过片段化酶片段化为25～125bp片段：(6)标记：连接上生物素标记；(7)杂交：将标记后产物与杂交液混合均匀并变性，加载于750 K芯片置于杂交箱子中，在50℃、60r/min条件下杂交16～18h；(8)冲洗、染色：将杂交后的芯片洗涤并染色；(9)扫描：将芯片放置于微阵列芯片扫描仪(博奥生物有限公司，LuxScan10K-B型)中获取相关数据；(10)分析：参照《染色体基因组芯片在儿科遗传病的临床应用专家共识》[6]对相关软件处理结果进行判读。

1.2.4 病理或随访：染色体核型分析、基因芯片单独及联合检查提示产前染色体畸变的孕妇在多学科联合会诊中心进行全面产前咨询，并根据孕妇意愿选择终止妊娠或继续妊娠至正常分娩；选择终止妊娠者，其引产胎儿由新生儿医生进行临床检查；未引产者根据胎儿出生后的症状、体征及染色体检查确诊。

1.3 观察指标 记录病理及随访结果；记录染色体核型分析、基因芯片单独及联合检查的异常情况。其中单项检查中任何一项异常则联合检查异常。

2 结果

2.1 病理及随访结果 经病理或随访确诊，125例疑似高危产妇中胎儿染色体畸变为22例。其中B超检查异常产妇中3例，不良孕产史产妇中2例，血清筛查高危产妇中5例，NT增厚产妇中10例，高龄孕妇中2例。

2.2 羊水染色体核型分析、基因芯片单独及联合筛查疑似高危孕妇产前染色体畸变情况 125例产妇羊水培养均成功，基因芯片均成功提取基因DNA。羊水染色体核型分析筛查中15例异常，检出率为68.18%(15/22)；基因芯片中15例异常，检出率为68.18%(15/22)；联合筛查检出22例，检出率为100.00%(22/22)，羊水染色体核型分析联合基因芯片联合筛查产前染色体畸变检出率高于单独技术筛查，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 羊水染色体核型分析、基因芯片筛查高危孕妇产前染色体畸变类型 羊水染色体核型分析、基因芯片筛查对染色体非整倍数、嵌合染色体检出率均为100.00%；羊水染色体核型分析对染色易位、倒拉检出率为100.00%，对微小片段缺失或重复检出率为0.00%；基因芯片对染色易位、倒拉的检查率为0.00%，对微小片段缺失或重复的检出率为100.00%。见表1。

表1 羊水染色体核型分析、基因芯片筛查高危孕妇产前染色体畸变类型[n(%)]

3 讨论

染色体是基因的载体，染色体异常可导致基因增加或缺失，从而导致胎儿发育异常、多器官或多组织畸形、多发自然流产或死胎等，是造成新生儿出生缺陷的重要原因之一。目前，羊水染色体核型分析是细胞遗传学中较为成熟的技术，通过提取高危孕妇羊膜腔内羊水，进行一系列脱落细胞培养等，可分析出染色体数目异常和较大片段的染色体缺失、重复、易位、插入、倒拉等，是降低出生缺陷的有效手段，且对孕妇再次生育时的再发风险评估与遗传咨询均具有指导性意义[7]。但临床多项研究发现，常规G显带核型分析无法检测微小片段缺失或重复，且样本污染或培养失败，无法得出分析结果[8-9]。因此，快速产前诊断技术的开发与应用研究得到了广泛的关注。

基因芯片即DNA芯片，其实质是Southern技术的反向应用，利用原位合成或已合成好的一系列寡核苷酸固定于介质上，制备呈高密度的寡核苷酸阵列，促使基因样本与探针在载体表面上杂交，可用于基因多态性、DNA测序、基因突变分析等[10]。该技术可检测出>1kb的染色体不平衡畸变，且无须制备中期染色体，只需1μg的DNA量就可检测出全基因组DNA拷贝数的变化，且全程由仪器操作，可减少人为主观因素的干扰，对提高产前染色体畸变筛查的准确率具有一定的作用[11]。但由于染色体的平衡性变异，不涉及遗传物质的丢失或增加，基因芯片无法检出染色易位、倒拉等情况[12]。因而，从理论上来说，羊水染色体核型分析联合基因芯片筛查产前染色体畸变可发挥各自的优势，可进一步发现染色体畸变情况。本研究结果显示，在125例疑似高危产妇中，羊水染色体核型分析联合基因芯片筛查出的产前染色体畸变检出率高于单项技术筛查，证实了上述推测，且分析两种方法检查的染色体畸变类型，发现羊水染色体核型分析可精确检测出易位、倒拉等大片段的染色体结构异常情况，而基因芯片可检测出微小染色体的缺失、重复情况，因而，二种检查方法可优势互补，可提高检查的准确率。

综上所述，高危孕妇产前染色体畸变筛查中运用羊水染色体核型分析联合基因芯片检查可减少单独检测的漏检率，提高检出率，对降低胎儿出生缺陷具有重要的指导作用。