葡萄脱落酸受体基因VvPYL4的生物信息学及表达分析

刘 丽，李柏宏，郑丽娇，王 辉，于舒怡，关天舒，刘长远

（1.植物保护研究所，辽宁省农业科学院，沈阳 110161；2.新民市农业农村局，沈阳 110300）

脱落酸（Abscisic acid，ABA）作为一类重要的植物激素，是植物生长发育的重要调节因子，同时也在植物应对生物和非生物胁迫反应中发挥着重要的调控作用。ABA 是调控植物对病原菌胁迫响应的重要分子。ABA 能够通过调控纤维素合成、气孔关闭等来阻止病原菌的入侵；除了调节其他激素系统和触发防御反应，ABA 还促进植物细胞中胼胝质的积累，限制病原菌的传播。ABA 对植物调控作用是通过ABA 受体与信号传导途径过程中关键组分的相互作用实现的。MA等通过遗传筛选和酵母双杂交的方法，在拟南芥中证实了PYR/PYL/RCAR 蛋白是ABA 的受体，并阐述了其在ABA 信号转导通路中的重要作用和调控机制。拟南芥研究表明PYR/PYL/RCAR 家族共有14 个成员，分别命名为PYR1 和PYL1-13（RCAR1-RCAR14），现已在葡萄（

Vitis vinifera

）中鉴定到 8 个 PYL 基因。不同的 PYR/PYL/RCAR 蛋白与 ABA 的结合能力不同。PYR/PYL/RCAR受体发挥识别传递ABA信号的关键功能，其能够感知ABA信号，激活下游基因的表达，提高植物抵抗不良环境的能力。大量研究发现在拟南芥、水稻、大豆、青蒿、草莓、香蕉和番茄等作物中PYR/PYL/RCAR家族基因成员过表达，可提高转基因作物对ABA的敏感性、抗旱性及促进果实成熟等。葡萄霜霉病是由专性寄生菌

Plasmopara viticola

引起的真菌性病害，是葡萄生产上危害最为严重的病害。该病菌属于专性寄生菌，通过叶背面的气孔入侵而导致发病。该病主要危害葡萄叶片和果实，每年造成的产量损失20%～30%，严重时80%以上，甚至是绝产，对葡萄产业健康发展造成严重危害与经济损失。目前防治霜霉病主要采用化学农药，由于频繁过量用药，易造成抗药性产生和果实及环境污染，严重威胁了果品安全。因此开展葡萄霜霉病抗病基因挖掘和抗性机制研究对葡萄抗病基因改良和培育新品种具有重要意义。PYR/PYL/RCAR 位于ABA 信号通路上游，是信号调节因子，具有识别ABA 信号和启动信号转导原初过程功能。烟草

Nt-PYL4

在毛状根中的过表达引起生物碱积累的下降。拟南芥

PYL4

的过量表达能够提高植物的抗旱性。

PbPYL4

基因在杜梨响应盐胁迫过程中起了重要作用。

PhPYL4

在矮牵牛对盐、干旱及ABA 等非生物胁迫的响应中具有重要作用。番茄植株中

SlPYL4

基因参与了干旱胁迫下ROS 积累及SOD、POD 和CAT 活性的调控。马宗桓等克隆得到6 个葡萄

PYL

基因，发现其高度保守，能够响应PEG、ABA 和NaCl 等不同非生物胁迫。ZHAO等鉴定了8个葡萄PYL基因，发现

VvPYL4

启动子含有低温和干旱胁迫诱导元件；从葡萄座果期到成熟期，果肉中

VvPYL1

、

VvPYL4

、

VvPYL7

和

VvPYL8

的表达水平显著增加，表明PYL 家族基因在果实成熟和发育过程中起着重要作用。PYR/PYL/RCAR 在ABA 介导的非生物胁迫响应中发挥重要作用，但其如何调控植物抗病鲜有报道。本研究室前期对霜霉病菌胁迫下抗感葡萄品种的转录组分析，发现

VvPYL4

基因在霜霉病菌侵染下显著上调表达，外源激素ABA 和MeJA 处理可显著诱导

VvPYL4

的表达，

VvPYL4

基因沉默可降低葡萄对霜霉病菌的抗性。虽然已证实

VvPYL4

在葡萄抗霜霉病中的作用，但对VvPYL4 蛋白和基因表达特性尚不清楚。因此，本研究拟通过生物信息学方法对葡萄

VvPYL4

基因结构和表达进行分析，明确其在不同葡萄组织、不同葡萄品种以及霜霉病菌胁迫不同抗性品种下的表达特征，为深入研究

VvPYL4

基因功能和作用模式奠定了基础，并为定向改良葡萄抗病新品种提供基因储备。

1 材料与方法

1.1 材料

供试葡萄（

Vitis vinifera

）品种贝达（高抗）、香悦（抗病）、87-1（感病）和无核白鸡心（高感），来自于辽宁省农业科学院植物保护研究所试验基地；供试葡萄霜霉病菌由辽宁省农业科学院植物保护研究所园艺病害研究室保存。

1.2 方法

1.2.1 霜霉病菌接种处理 取葡萄品种贝达、香悦、87-1和无核白鸡心枝条顶端新鲜叶片，喷雾霜霉病菌孢子囊悬浮液，浓度为1×10个·mL。密封保湿，22℃下光暗交替培养。每个处理重复3 次，每重复10 片叶。在接种后6，24，48，72，96h 时剪取4 个葡萄品种处理组叶片，无菌水喷雾叶片0h 作为对照组，取完样品后用锡纸包好，立即放于液氮中迅速冷冻0.5h，然后将样品保存于超低温（-80℃）冰箱。

1.2.2 总RNA的提取 选择接种霜霉病菌后6h 的贝达葡萄叶片，参照天根生物公司RNAprep Pure 植物总RNA提取试剂盒（离心柱型DP432）提取总RNA。

1.2.3 序列扩增 根据转录组所得数据进行NCBI BLAST 比对，设计一对引物由起始密码子到终止密码子进行扩增。PYL4 F：5’-3’ATGCCCTCAAACCCTCCAA ；PYL4 R：5’-3’TCATGACGATGACCTCTTGCAG。PCR 反应体系包括cDNA 模板1.0μL，LA TAQ(5U·μL)0.2μL，2×LA TAQ BUFFER 2μL，dNTP(2.5mmol·L)4μL，上下游引物各1μL，补足ddHO 至20μL。反应程序为：94℃，预变性5min；94℃，变性30s，55℃，退火30s，72℃，延伸1min，扩增进行35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

1.2.4 目的片段的纯化与回收 选择琼脂糖凝胶回收试剂盒（AXYGEN 公司）进行目的片段的回收与纯化。利用1.0%琼脂糖凝胶将回收纯化产物进行电泳，并在紫外灯下观察回收效果。

1.2.5

VvPYL4

表达载体构建及测序 采用T4 DNA 连接酶将回收纯化产物连接到pGEM-T 克隆载体上，并转化大肠杆菌感受态TOP10，在含氨苄青霉素的LB 固体培养基平板上涂板，挑取饱满透明的单菌落在培养基中振荡培养，经PCR鉴定为阳性的菌液送Invitrigen公司进行测序鉴定。

1.2.6 VvPYL4生物信息学分析 利用DNAman6.0 软件进行多序列比对，MEGA7.0 进行系统进化树分析。运用生物信息学软件，对VvPYL4 的蛋白序列进行分析。利用在线网站ProtParam、ProtScale 分析和预测VvPYL4蛋白的基本理化性质；TMHMMServer2.0和SignalP4.1在线预测VvPYL4蛋白的跨膜结构和信号肽；利用SPOMA和Plant-mPLoc预测VvPYL4蛋白的二级结构及亚细胞定位；利用KEGG预测VvPYL4蛋白的代谢通路。

1.2.7 利用qRT-PCR分析

VvPYL4

基因的表达模式 分别取贝达葡萄的根、茎、叶提取RNA，采集贝达、香悦、87-1、无核白鸡心叶片提取RNA，将提取的RNA 反转录合成cDNA；利用软件Primer premier 6.0 设计葡萄

VvPYL4

基因荧光定量引物，上游引物为5’-CCGTCGTCCAGCAAATCG-3’，下游引物为5’-ACATCTCCATCGCCAACAAC-3’。以葡萄EF1a 蛋白基因为内参基因，上游引物为5’-GAACTGGGTGCTTGATAGGC-3’，下游引物为5’-ACCAAAATATCCGGAGTAAAAGA-3’。以反转录合成的cDNA 为模板，通过qRT-PCR 检测

VvPYL4

基因的表达情况。SYBR Green 法体系包括2×SYBR Green Mix 5μL，上下游引物各0.5μL，cDNA 模板2μL，补足ddHO 至 10μL。反应程序为：预变性95℃，5min；变性95℃，10s，退火延伸60℃，30s，扩增 40 个循环；熔解曲线采集95℃，15s，60℃，60s，95℃，30s，95℃，15s。试验每个处理取10株苗，并设置3个生物学重复，利用2法计算基因的相对表达量，并用SPSS 11.0和Excel 2007进行统计分析和作图。

2 结果与分析

2.1 葡萄VvPYL4基因的克隆及序列分析

提取贝达葡萄叶片的总RNA，反转录成cDNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增，产物经电泳检测，获得一条大约700bp 的扩增片段（图1）。将

VvPYL4

基因经T 载体连接，阳性克隆筛选后，测序得到了大小约为700bp 的目的基因片段（图2 和图3）。葡萄

VvPYL4

基因的CDS 全长为684bp，具有1 个外显子，无内含子，具有351bp 5’-非编码区（UTR）和287bp 3’-UTR。

图1 VvPYL4扩增PCR产物电泳结果Figure 1 The electrophoresis result of PCR product in VvPYL4

图2 VvPYL4单克隆菌落PCR产物电泳结果Figure 2 The electrophoresis result of PCR product in monoclonal colony of VvPYL4

图3 VvPYL4基因全长测序比对结果Figure 3 The sequencing comparison result of whole-length VvPYL4 gene

2.2 葡萄VvPYL4基因编码蛋白的生物信息学分析

2.2.1 理化性质分析 运用ProtParam、ProtScale 数据库对VvPYL4 进行了理化性质分析，结果显示VvPYL4蛋白由228 个氨基酸组成，相对分子质量为24.28kDa，不带负电荷的残基大致在17，带正电荷的残基20，等电点（pI）为8.59；VvPYL4 疏水指数平均数为-0.241，属于亲水蛋白（图4），蛋白的不稳定指数为51.73，其活性稳定性较差；VvPYL4 脂肪族氨基酸指数为85.15，属于含脂类较高的蛋白。

图4 VvPYL4编码蛋白的疏水性分析结果Figure 4 The hydrophobicity profile of the induced protein of VvPYL4

2.2.2 二级结构分析 运用SOPMA 数据库对VvPYL4的二级结构进行预测，预测结果VvPYL4

α

螺旋（HH）为67（29.52%），延伸链（EE）为44（19.38%），

β

转角（TT）为19（8.37%），不规则卷曲（cc）为97（42.73%）（图5）。

图5 VvPYL4二级结构预测Figure 5 Secondary structure prediction of VvPYL4

2.2.3 亚细胞定位、信号肽和跨膜结构分析 利用Plant-mP 软件对VvPYL4 亚细胞定位预测，结果显示VvPYL4 定位在细胞质中。利用LocSignalP 4.1 在线软件对VvPYL4 肽信号的有无进行预测，结果显示VvPYL4无信号肽（图6）。运用TMHMM数据库对VvPYL4进行了跨膜结构预测，结果显示无跨膜结构（图7）。

图6 VvPYL4蛋白的信号肽预测结果Figure 6 Signal peptide prediction in the protein of VvPYL4

图7 VvPYL4蛋白的跨膜区预测Figure 7 Prediction of transmembrance regions of VvPYL4

2.2.4 结构域分析 运用Smart 数据库对VvPYL4 进行了功能结构域分析，结果显示VvPYL4 含有结构域Polyketide_cyc2，拥有该结构域的家族属于聚酮化合物环化酶/脱水酶家族，是参与聚酮化合物合成的酶，并含有START超家族的其他蛋白质。

2.2.5 蛋白通路分析 运用KEGG 数据库对VvPYL4 蛋白通路进行分析，结果显示VvPYL4 蛋白参与植物MAPK 信号通路（MAPK signaling pathway-plant vvi04016）和植物激素信号转导通路（Plant hormone signal transduction vvi04075）。

2.3 系统进化树构建及分析

为研究VvPYL4 蛋白与其他物种中PYL4 的亲缘关系，利用MEGA 7.0 软件，将葡萄VvPYL4 与已公布的拟南芥、烟草、黄瓜、番茄、大豆、胡杨、木薯等20 个物种的PYL4 序列进行聚类分析，并构建系统发育进化树。结果表明：VvPYL4与其他物种中的PYL4起源相同，但在进化的不同时期逐渐与其他物种分离开来。VvPYL4和拟南芥AtPYL4聚为一枝，亲缘关系最近，而与大豆GmPYL4和山核桃CiPYL4亲缘关系较远（图8）。

图8 VvPYL4系统进化树分析Figure 8 Phylogenetic tree of VvPYL4

2.4 VvPYL4基因在葡萄不同组织中的表达分析

利用荧光定量PCR技术，对

VvPYL4

在葡萄不同组织中的表达水平进行检测。由图9可知，

VvPYL4

在葡萄的茎、根、叶中均有表达。

VvPYL4

的表达水平从高到低依次为：根＞叶＞茎。根中的表达量约为茎中的15倍，而叶中的表达量约为茎中的7倍。说明

VvPYL4

的表达具有明显的组织特异性。

图9 葡萄不同组织VvPYL4的相对表达量Figure 9 Relative expression of VvPYL4 in different tissues of grapevine

2.5 VvPYL4基因在葡萄不同品种中的表达分析

利用荧光定量PCR 技术，对

VvPYL4

在葡萄不同品种中的表达水平进行检测。由图10 可知，以

VvPYL4

在无核白鸡心中表达量为基准1.00，

VvPYL4

在贝达中表达量最高，在香悦中表达量最低，

VvPYL4

基因在葡萄不同品种中的表达量有所差异。

图10 葡萄不同品种VvPYL4的相对表达量Figure 10 Relative expression of VvPYL4 in different varieties of grapevine

2.6 VvPYL4基因在葡萄霜霉病菌胁迫下的表达分析

由图11 可知，

VvPYL4

的表达受到了葡萄霜霉病菌的诱导，在霜霉病菌侵染后6h，

VvPYL4

基因在4 个葡萄品种中的相对表达量显著升高，在高抗品种贝达中的表达量上调最高，在高感品种无核白鸡心中的表达量上调最低。在霜霉病菌侵染后48h，

VvPYL4

基因在抗病品种香悦中的表达量上调最高。随着侵染时间的延长，到霜霉病菌侵染后96h，

VvPYL4

基因在高抗品种贝达中的表达量上调最高，在感病品种87-1中的表达量下调到最低。可见，

VvPYL4

基因参与了葡萄对霜霉病菌侵染的防御反应，但在不同抗性葡萄品种中的表达有显著差异。

图11 VvPYL4基因在不同葡萄品种接种霜霉病菌后的相对表达量Figure 11 Relative expression of VvPYL4 in different varieties of grapevine inoculated with P.viticola

3 讨论与结论

ABA 受体蛋白PYR/PYL/RCAR 是一类重要的植物逆境应答因子，主要功能是识别ABA 信号和启动信号的传递，在ABA 信号转导途径中起重要作用。SANTIAGO等以蛋白磷酸酶HAB1为诱饵筛选到相互作用的蛋白PYL5、PYL6和PYL8，并重点阐明了PYL5作为受体蛋白介导ABA信号应答的分子机制。根据前期转录组测序研究表明脱落酸受体基因PYL4参与了葡萄对霜霉病菌胁迫的响应过程，为了探明其生物学功能，本研究通过PCR 手段从葡萄叶片中克隆获得了

VvPYL4

基因全长，并且对其进行了生物信息学分析。经测序表明，

VvPYL4

基因全长684bp，具有1 个外显子，无内含子，具有351bp 5’-非编码区（UTR）和287bp 3’-UTR。蛋白序列分析表明，VvPYL4蛋白由228个氨基酸组成，相对分子质量24.28kDa，是亲水蛋白和含脂类较高的蛋白。预测VvPYL4定位在细胞质中，无信号肽，无跨膜结构，含有结构域Polyketide_cyc2，参与植物MAPK 信号通路和植物激素信号转导。进化树结果显示，VvPYL4 蛋白与拟南芥AtPYL4 亲缘关系最近。通过qRT-PCR 技术分析

VvPYL4

基因的表达模式，发现

VvPYL4

在葡萄不同组织中具有表达特异性，在不同葡萄品种中表达量有显著差异，在不同抗霜霉病葡萄品种中的表达量有显著差异。本研究为后续揭示

VvPYL4

功能奠定了理论基础。PYR/PYL/RCAR 蛋白家族成员含有START结构域，属于脂质转运相关蛋白家族，广泛地分布于细胞质和细胞核内，在细胞内或细胞质膜附近感知ABA。LI等研究表明葡萄VvPYL1亚细胞定位于细胞质和细胞核中；马宗桓等研究表明PYL 家族成员主要定位于细胞质中，并且有多个保守位点；而ZHAO 等亚细胞定位预测发现葡萄VvPYL2，VvPYL4 和VvPYL8 蛋白只定位在细胞核。本研究中预测VvPYL4 含有START 超家族的蛋白质，定位在细胞质中。PYR/PYL/RCAR 受体是ABA 信号传导路径中的一个核心组分，其基因表达强弱直接影响到ABA 的作用。PYLs 在植物体内的表达量和组织特异性不同，因此不同的PYR/PYL/RCAR 蛋白与ABA的结合能力不同，在功能上也具有一定的差异。油棕

EgPYLs

基因在根、茎尖、叶、花和果肉中均有表达，但表达量差异较明显。矮牵牛

PhPYL4

的表达水平从高到低依次为：叶＞茎＞根，具有明显的组织特异性。LI等发现

VvPYL

在叶、茎和根中的表达量都比较高；ZHAO 等发现

VvPYL1

、

VvPYL2

、

VvPYL4

、

VvPYL7

和

VvPYL8

在根中表达较高。在本研究中葡萄

VvPYL4

的表达水平从高到低依次为：根＞叶＞茎，在葡萄不同组织中表达具有特异性。系统进化树显示VvPYL4 蛋白与拟南芥AtPYL4 亲缘关系最近，表明葡萄VvPYL4 蛋白可能具有与拟南芥AtPYL4 蛋白相似的功能。在霜霉病菌胁迫下，

VvPYL4

基因在高抗病品种贝达中的表达量总体趋势均高于其在高感品种无核白鸡心中的表达量。表明

VvPYL4

参与葡萄抗霜霉病的响应。本研究已经对葡萄

VvPYL4

的理化性质及部分功能进行了解析，由于基因功能的复杂性和不同物种生长发育的特异性，还应进一步对葡萄

VvPYL4

的调节途径和作用机理进行探讨和分析。