NFE2L2对食管鳞状细胞癌ECA109细胞生物学行为的影响

食管癌是常见的消化系统恶性肿瘤，目前食管癌的致死率已位居全球第六位

。除此之外，食管癌患者总体5年生存率仅为15%～25%

。食管癌高致死率、低生存率的特点与患者早期淋巴结转移及治疗疗效欠佳密切相关。因此，为了降低患者死亡率，改善预后，寻找抑制食管癌转移的治疗靶点十分重要。

选取120例乳腺疾病患者作为研究对象,乳腺病灶共计154个。所有患者均接受超声弹性成像检查。患者均为女性,年龄23-64岁,平均年龄(40.31±3.55)岁;超声弹性成像检查下可看到实性肿块,经手术切除病理检查之后得到证实。

核转录因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid2-like2，NFE2L2)是细胞中一种抗氧化转录因子

，其编码的蛋白Nrf2在宫颈癌、肺癌、卵巢癌等恶性肿瘤的进展中均发挥重要作用

。Zhang等

发现，Nrf2在人食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)组织中高表达，并与患者生存率低相关，提示NFE2L2可能参与ESCC的发生发展，但NFE2L2对ESCC生物学行为影响的报道较少。本研究基于此背景，通过下调及上调人ESCC细胞株ECA109中NFE2L2的表达，观察该基因在ESCC侵袭、迁移、增殖、凋亡中的作用，为食管癌的靶向治疗提供理论依据。

1 材料与方法

乳腺增生性病变与早期乳腺癌在常规超声诊断过程中存在重叠现象进而容易发生诊断误差，需要予以重要补充，降低诊断重叠部位的误诊和漏诊率[7-8]。

1.1.1 细胞株：人ESCC细胞株ECA109购自武汉普诺森生命科技有限公司。

1.1.2 主要仪器及耗材：细胞培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)；PCR扩增仪(美国Thermo公司)；β-actin兔抗人多克隆抗体(美国BOSTER公司，货号：BA2305)；NFE2L2兔抗人单克隆抗体(英国Abcam公司，货号：ab62352)；TaKaRa反转录试剂盒(货号：RR047A)；CKK-8试剂盒(日本同仁公司，货号：CK04)；Matrigel胶(美国BD公司，货号：356234)；慢病毒试剂盒(上海吉凯基因公司)。

侵袭实验结果显示，ECA109经NFE2L2 siRNA1、siRNA2干预48 h后，干预组侵袭细胞数较对照组减少(见表3、图2)；ECA109经NFE2L2质粒过表达48 h后，NFE2L2过表达组侵袭细胞数较空白对照组增加(见表4、图3)，差异均有统计学意义(

<0.05)。

1.2.4 qRT-PCR法：Primer Premier 5.0软件设计引物，BLAST验证后，委托上海生工生物公司合成备用(NFE2L2：F-TCAGCGACGGAAAGAGTATGA,R-CCACTGGTTTCTGACTGGATGT;β-actin:F-ATGATGATATCGCCGCGCTC,R-TCGATGGGGTACTTCAGGG)。使用Trizol、氯仿、异丙醇、75%乙醇提取RNA，逆转成cDNA。然后将cDNA进行qRT-PCR检测基因表达。

肾脏集合管癌是起源于肾脏髓质集合管远端的恶性上皮肿瘤，极为少见，约占所有类型肾细胞癌的1%～2%，FLEMING等[2]于1986年首次提出其为独立的肾细胞癌病理亚型，其恶性程度高，进展快，大部分患者发现时已有肾外转移，约80%的患者最终转移到淋巴结、肺、肝、脑及骨。2008年8月至2017年8月我院收治的所有肾细胞癌患者中仅出现12例CDC患者。

1.2.2 细胞转染：构建NFE2L2过表达质粒(F：TCCGCTCGAGATGATGGACTTGGAGCTGCC；R：ATGGGGTACCGAGTTTTTCTTAACATCTGGC)及NFE2L2小干扰RNA(siRNA1：5′-CCAACCAGUUGACAGUGAACUCAUU-3′；siRNA2：5′-CAAACUGACAGAAGUUGACAAUUAU-3′)待用。将细胞接种在6孔板，生长至85%时转染，不做处理组为空白对照组，转染随机序列组为阴性对照组。

（2）开题报告是学生毕业设计前期工作重点。学生在获取任务书后，通过文献检索了解选题在相应学科领域中的发展进程和研究方向和最新成果，并阅读教师在任务书中规定的中外文献参考资料。学生在阅读文献和社会调研的基础上写出开题报告。

1.2.5 Transwell小室检测细胞侵袭能力及迁移能力：(1)侵袭实验：上室接种5×10

个细胞(无血清)，下室加入含10%血清培养液，培养箱孵育24 h，取上室甲醛固定，穿膜细胞Giemsa染色，显微镜下选取5个随机视野进行观察拍照，记录穿膜细胞数目进行统计。(2)迁移实验：将Matrigel胶置于4 ℃冰箱过夜，用RPMI-1640稀释至1 mg/ml，取100 μl平铺在上室，37 ℃孵育6 h凝固成胶。后续步骤同侵袭实验。

注：与空白对照组相比，△

<0.05，▽

<0.001；与空转组相比，▲

<0.05，▼

<0.001。

细胞凋亡结果显示，ECA109经NFE2L2 siRNA1、siRNA2干预48 h后，细胞早期凋亡率较对照组增加，差异有统计学意义(

<0.01，见表5、图5)；ECA109经NFE2L2 质粒过表达后，细胞早期凋亡率与对照组相比，差异无统计学意义(

>0.05，见表6)。

受试者清晨空腹取直立位,检测身高、体重、体重指数(BMI)=体重/身高2(kg/m2)、腰围,并抽空腹静脉血4-5ml,备测甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)在某医院检验科用日本日立7060全自动生化分析仪测定。

2 结果

qRT-PCR及Western blotting结果显示，ECA109经NFE2L2 siRNA1、siRNA2干预后，NFE2L2在基因水平和蛋白水平均较对照组降低(见图1A、表1)；ECA109经NFE2L2过表达质粒干预后，NFE2L2在基因水平和蛋白水平均较对照组升高(见图1B、表2)，差异有统计学意义(

<0.05)。

1.2.1 细胞培养：细胞培养基使用90%RPMI-1640+10%FBS+1%双抗，细胞置于体积分数为5%的CO

、37 ℃培养箱孵育，细胞呈对数生长期时进行后续实验，以下实验均重复3次。

1.2.6 CCK-8检测细胞增殖能力：96孔板每孔接种2×10

个细胞，培养至充分贴壁，每孔加入CCK-8染色液100 μl，37 ℃避光孵育4 h，酶联免疫标记仪检测其吸光度值(

)，计算细胞增殖率。

1.2.3 Western blotting法：细胞裂解液(含磷酸酶、蛋白酶抑制剂)裂解后，12 000 r/min,4 ℃,离心15 min后取上清液，BCA定量检测蛋白浓度，凝胶电泳分离，恒流冰浴转膜，4 ℃一抗孵育过夜(NFE2L2及β-actin抗体均稀释至1∶500)，二抗(山羊抗兔)室温孵育2 h，暗室在PVDF膜上滴ECL液，发光后压片曝光，扫描图片进行分析。

迁移实验结果显示，ECA109经NFE2L2 siRNA1、siRNA2干预48 h后，干预组迁移细胞数较对照组减少(见表3、图2)；ECA109经NFE2L2质粒过表达48 h后，NFE2L2过表达组迁移细胞数较对照组增加(见表4、图3)，差异均有统计学意义(

<0.05)。

细胞周期结果显示，ECA109经NFE2L2 siRNA1、siRNA2干预48 h后，干预组G

/G

期细胞百分比较对照组增加，干预组S期细胞百分比较对照组减少(见表5、图4)；ECA109经NFE2L2质粒过表达后，G

/G

期细胞百分比较对照组减少，S期细胞百分比较对照组增加(见表6)，差异均有统计学意义(

<0.05)。

1.2.7 流式细胞仪检测细胞凋亡：将细胞与1 ml结合缓冲液充分混匀至浓度为1×10

个/ml，取100 μl细胞悬液加入5 ml流式管，每个流式管加入10 μl碘化丙啶，避光静置15 min，流式细胞仪上机检测细胞凋亡情况。

3 讨论

食管癌是常见的消化道恶性肿瘤，是世界上发病率较高且致死率极高的癌症之一

。据统计，世界上每年约有50万人死于食管癌，占全球癌症死亡总数的5.3%，值得注意的是，亚洲食管癌患者占全球所有食管癌病例的78%，而这其中49%的病例来自我国，除此之外，我国食管癌患者的死亡率也居世界前列，且具有显著的地域差异

，提示食管癌与基因遗传易感性及环境因素有关。现阶段，尽管科研工作者在治疗食管癌方面付出了巨大的努力，但食管癌患者总体5年生存率仍然很低(15%～25%)，食管癌患者预后与食管癌的早期诊断及转移密切相关

。而食管癌的转移机制十分复杂，目前尚不完全清楚，有待进一步阐明为其靶向治疗提供方向和思路。

NFE2L2是一种具有保护性的抗氧化转录因子，是氧化应激反应的前线效应器，它能够反式激活至少1 000个保护基因表达减少细胞的急性损伤，正常细胞环境下，其编码的蛋白Nrf2受上游适配器蛋白KEAP1的负调节，两者形成复合物共同参与调节细胞内的氧化应激反应，而Nrf2/KEAP1轴则被认为是细胞防御和生命通路的中枢节点

。转录因子NFE2L2主要位于细胞质中，在食管、甲状腺和其他组织中广泛表达

，其编码的蛋白Nrf2介导的氧化应激在宫颈癌中起重要作用

，在宫颈癌细胞增殖、侵袭、转移方面起促进作用，且抑制宫颈癌细胞的凋亡

，同时增加肿瘤化疗的抵抗性

，提示NFE2L2可能是判断宫颈癌患者预后的重要标志

。此外，NFE2L2/KEAP1复合体的基因突变可促使肺鳞状细胞癌内出现氧化还原亚型，影响肺鳞状细胞癌患者的预后

。回顾NFE2L2与食管癌方面的有关报道，一方面，有研究发现，Nrf2的过度表达可增加ESCC的抗辐射能力，与ESCC患者生存率低密切相关

；且miR-142-5p可靶向负调控食管癌细胞中Nrf2的表达，抑制食管癌迁移

。另一方面，有研究

显示，Nrf2基因敲除小鼠对硝基亚氧喹啉诱导舌癌和食管癌的敏感性明显高于野生型小鼠。因此，NFE2L2对食管癌增殖、侵袭和迁移的影响有待进一步阐明。

食管癌在组织学上可分为ESCC和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma，ECA)。ESCC是食管癌的主要亚型，约占全世界食管癌病例的90%

。因此，本文选用人ESCC细胞株ECA109进行研究，通过下调及上调ECA109细胞中NFE2L2基因，探讨该基因对ESCC生物学行为的影响。

牙齿是人体的重要组成部分，其解剖形态在不同民族和地区间存在一定的差异[1]。维吾尔族在遗传、生活习俗、生活环境等与汉族明显不同，其牙体解剖形态上也具有不同特点。目前,国内外有很多学者对不同民族、不同地区的恒牙解剖形态进行了相关研究[2-4]。而对维吾尔族牙齿解剖结构的研究较少，且研究样本量也较小[5-6]。牙齿测量是研究牙齿形态的最基本方法,本研究对新疆地区维吾尔族第一前磨牙的解剖形态进行测量，以期为新疆地区口腔临床、教学和科研提供解剖学资料和理论依据。

ESCC的早期淋巴结转移是其患者预后差、生存率低的主要原因

。本研究结果显示，下调ECA109细胞中NFE2L2基因后，干预组细胞侵袭能力较空白对照组及阴性对照组明显降低，而上调ECA109细胞中NFE2L2基因后，干预组细胞侵袭能力较空白对照组及空转组明显增加。除此之外，本研究中Transwell小室实验结果显示，与空白对照组及阴性对照组相比，ECA109 siRNA组细胞迁移数目明显减少，而质粒过表达组则结果相反。因此，我们推测NFE2L2基因参与ESCC细胞上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transformation，EMT)促进ESCC的侵袭和迁移。这与Xiao等

的研究结果一致。针对NFE2L2促进ESCC侵袭和迁移的机制，现阶段学者发现与代谢

、Notch信号通路

、PI3K/AKT信号通路

相关，但尚未找到有效治疗ESCC的方法，有待进一步研究其具体机制。

☆秋风阵阵，枝头上的树叶纷纷飘落。有的如蝴蝶，扇动着美丽的翅膀；有的如蜜蜂，转着“8”字飞舞；有的如降落伞，缓缓地打着旋儿……一片片树叶，无论是怎样飞舞，都会缓缓落下，在地上铺成一条金色的道路。

在肿瘤的化疗过程中，癌细胞进化并获得“耐药性”，这大大限制了肿瘤治疗的有效性，影响患者的生存和生活质量。因此，调节癌细胞的增殖存活、凋亡以及耐药性也是肿瘤研究的重要方向

。有研究

显示，前列腺癌中p62通过抑制Keap1介导的蛋白酶体的降解而降低Nrf2的水平和活性，从而抑制前列腺癌细胞的增殖，同时增加其凋亡速率。除此之外，Fan等

研究发现，神经胶质瘤细胞中Nrf2过表达可促进肿瘤细胞增殖和致瘤转化。本研究结果显示，下调ECA109细胞中NFE2L2基因后，干预组G

/G

期细胞数显著增加，S期细胞数显著减少，对细胞的分裂及DNA的复制抑制作用显著；而上调NFE2L2的表达后，G

/G

期细胞数显著减少，S期细胞数显著增加，对细胞的分裂及DNA的复制促进作用显著。除此之外，ECA109细胞株经过NFE2L2 siRNA干预后，siRNA干预组细胞早期凋亡率较对照组细胞明显增加，但经NFE2L2质粒过表达后，细胞早期凋亡率与对照组差异无统计学意义。提示NFE2L2具有抑制食管癌细胞增殖、促进食管癌细胞凋亡的作用。

综上所述，NFE2L2基因与人ESCC细胞的EMT密切相关，并与该肿瘤的耐药性相关，但具体机制尚不完全明确，需进一步研究。本课题组下一步将对NFE2L2基因参与人ESCC细胞的EMT信号通路及分子机制进一步深入研究，力求为食管癌的治疗提供依据。

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