噪声暴露人群的耳钙粘蛋白基因(CDH23)多态性、miR-96、miR-183基因变异性与听力损伤易感相关性

郑雪丽 王成进 陈文渊 李萍 何晓菲 徐学海

1河西学院附属张掖人民医院耳鼻咽喉头颈外科

2河西学院临床医学院

3中国人民解放军联勤保障部队第940医院耳鼻咽喉头颈外科

噪声性听力损失（Noise-induced hearing loss，NIHL）多因长时间暴露于交通、工业、娱乐等环境噪声引起，早期多为高频听力下降，逐渐累及言语频率，产生不同程度的感音神经性聋[1-3]。NIHL存在个体差异，需注重基因学调查[4]。群体遗传学研究显示，耳钙粘蛋白基因(Objective To investigate the association of cadherin 23，CDH23)参与前庭毛细胞和耳蜗毛细胞静纤毛束的形成，其是否作为听力损失易感性影响因素尚未肯定[5]。miRNAs参与了个体发育以及细胞凋亡、分化、增殖等生命过程，其中miR-183家族，包括miR-96、miR-183，在内耳毛细胞有表达，不仅影响耳蜗毛细胞形态，还可调节耳蜗毛细胞发育进程，在哺乳动物听觉系统发育中有一定作用[6]，但其基因突变是否影响听力损伤的研究较少，尚未达成共识。本文总结分析耳钙粘蛋白基因(CDH23)多态性及miR-96与miR-183基因变异与听力损伤易感性的关系。如下文报道。

1 资料和方法

1.1 资料

回顾性分析的259例噪声暴露人群基本资料，符合《赫尔辛基宣言》的伦理审查。其中，男191例，女68例；年龄30-68岁，平均年龄（47.45±9.48）岁；接触时间4-20年，平均（11.45±3.64）年。接触史：123例存在有机溶剂接触史，127例存在重金属接触史，121例存在粉尘接触史，119例存在高温接触史。此次试验在2019年2月至2020年4月期间开展。根据纯音听力、听神经动作电位(Compound action potential，CAP）、畸变产物耳声发射（And distortion product otoacoustic emission，DPOAE）测试分为两组，即听力损伤组89例，对照组170例。纳入标准：①长期在噪声暴露环境下工作，噪声暴露强度≥80dB；②均处于同一水平噪声暴露环境下工作者。排除标准：①先天性听力受损者；②完全丧失听力者；③沟通、交流障碍者；④近期接受过中耳手术者；⑤存在头部外伤史、爆震史。

1.2 方法

一般资料调查：收集人口统计学特征（年龄、性别等）、既往史（中毒史、家族性耳聋病史、中耳炎病史）、生活习惯（饮酒、吸烟）、药物使用史、重金属接触史（包括汞、镉、铅、铬、金属砷等成分）、有机溶剂接触史（包括正己烷、戊烷、汽油、苯、苯乙烯、丁基甲苯、乙烯基甲苯、三氯乙烯、二氯甲烷等成分）、粉尘接触史、高温接触史以及噪声暴露情况。

纯音听力测试：由专业人士按照《职业性噪声聋诊断标准》[7]进行判定。在隔音室内（本底值噪声＜25dBS）用丹麦国际听力设备仪器As216听力计对所有研究对象开展6个频率（500Hz、1000Hz、2000Hz、3000Hz、4000Hz、6000Hz）的纯音气导听阈测试。听力损伤：双耳高频3000Hz、4000Hz、6000Hz平均听阈≥40dB。

DPOAE测试：耳声发射分析系统选择Madsen公司提供的CAPELIA系统进行DPOAE测试。邀请受检者坐于隔声（噪音＜28dBS）屏蔽室内。以两个连续具有一定频率比关系的f1、f2纯音作为第一次刺激信号，强度为60、70dB SPL，频率比f2/f1=1.22，选取2f2-f1的频率幅度值，每个点叠加32次，记录8个频率点的信噪比和反应幅值。听力损伤：信噪比＞6dB SPL。

CAP：在声电屏蔽的测听室内完成记录，用SS-1型声刺激器形成的短纯音和CLick音刺激，短纯音上升下降时间1ms，CLick期限1ms，平台5ms，诱导电位经FZG-81前置放大器放大，30-3000KHz滤波，输入平均20次电脑叠加，记录刚出现CAP波形所需最低声强度为阈值，暴露前、后CAP阈值差值为阈移。听力损伤：阈移＜10dB，CAP-N1峰潜伏期1.45±0.10ms。

CDH23多态性分析：DNA提取：抽取受检者5mL肘静脉血，肝素抗凝，分离淋巴细胞需使用密度梯度离心法。基因分型：在分析CDH23基因多态性时采用聚合酶链式反应-限制性片段。反应条件和PCR引物序列如表1。miR-96、miR-183基因检测：采用美国LIFE TECHNOLOGIES公司提供ABI GENE AMP PCR SYSTEM 9700聚合酶链式反应仪进行扩增。

1.3 统计学处理

采用SPSS22.0统计学软件处理，一般资料用（%）表示，行χ2检验，将单因素筛查出有统计学意义的指标纳入到二元Logistics回归模型分析；相关性用Spearman法分析，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 基因突变检测

259例测序样本中，共发生CDH23基因突变21例，有明确突变位点12例，分别为rs980743065（4例）、rs1006266313（3例）、rs199844049（5例）、rs561600796（6例）、rs760701558（3例），突变频率8.11%（21/259）。miR-96基因突变 5.79%（15/259）；miR-183基因突变率5.02%（13/259）。

2.2 比较一般资料

两组比较性别、吸烟史、饮酒史不存在统计差异性（P＞0.05），但比较年龄、重金属接触史、有机溶剂接触史、粉尘接触史、高温接触史、工龄、CDH23基因、miR-183基因、miR-96基因存在统计差异性（P＜0.05）。如表2所示。

表2 对比一般资料Table 2 Comparison of general information

上接表2

2.3 二元Logistic因素分析

以“听力是否受损”为因变量（赋值：0=未受损，1=受损），以“年龄（0=≤40岁；1=＞40岁）、有机溶剂接触（0=否；1=是）、重金属接触（0=否；1=是）、粉尘接触（0=否；1=是）、高温接触（0=否；1=是）、工龄（0=≤5年；1=＞5年）、CDH23基因（0=基因未突变；1=基因突变）、miR-96基因（0=基因未突变；1=基因突变）、miR-183基因（0=基因未突变；1=基因突变）”为自变量，纳入二元Logistic回归分析，结果显示，接触重金属、接触高温、工龄＞5年、CDH23基因突变、miR-96基因突变、miR-183基因突变是影响听力受损的独立因子（P＜0.05），年龄、接触有机溶剂、接触粉尘属于可疑因素。见表3。

表3 分析影响听力受损的二元因素Logistic回归Table 3 Logistic regression analysis of binary factors affecting hearing loss

2.4 分析各指标间相关性

听力受损与重金属接触、粉尘接触、高温接触、工龄、CDH23基因、miR-96基因、miR-183基因呈正相关性、（r=0.203；P=0.001）、（r=0.206；P=0.001）。

2.5 分析各基因型分布情况

表4数据显示，两组比较CDH23-Exon7的末位单核苷酸位点AA、AG、GG基因型分布及A/G等位基因频率存在统计差异性（X2：39.084；P＜0.001）、（X2：14.458；P＜0.001）。

表4 分析不同CDH23基因型分布（n=89/170）Table 4 Analysis of the distribution of different CDH23 genotypes(n=89/170)

图1 miR-96与miR-183基因的SNPs测序图。Fig.1 SNPs sequencing map of miR-96 and miR-183 genes.注：图1a-1b为miR-96:rs41274239基因型TT,rs73159662基因型GG；图1c-1d为miR-183:rs41281222基因型CC,rs72631833基因型GG。

3 讨论

NIHL是第二大类感音神经性听力损伤[8]，可因长时间接触有害噪声引发神经性听觉受损，若未及时发现、治疗，可对人体造成不可逆损伤，故WHO已将其归纳为公共卫生重点防御疾病。国外已有研究表明[9]，NIHL发病与基因变异有关，但国内关于此类报道较少，为了给予临床新的科学依据，本文就CDH23基因多态性、miR-96基因、miR-183基因与NIHL相关性进行了深入探索。

经二元Logistic分析，CDH23基因突变、长期接触重金属、长期接触高温、工龄＞5年、miR-96基因过度表达、miR-183基因过度表达是导致听力受损的独立因子。作用机制如下：（1）CDH23是钙粘蛋白超家族的成员之一，被认为与毛细胞束形成和静纤毛的组织结构有关，常表达于感觉神经上皮细胞表面。当人体长时间处于噪声暴露环境下，可导致内耳毛细胞静纤毛损伤[10]。而本次单因素分析中，听力受损者CDH23基因突变率更高，从而佐证CDH23基因突变与听力受损存在明显相关性。可能与CDH23基因突变使内耳神经上皮细胞退化相关，使得毛细胞的静纤毛组织遭到破坏，从而导致前庭功能失调和耳聋。胡娟[11]通过小鼠实验发现，携带CDH23基因突变的小鼠存在静纤毛束排列紊乱，出现高频和低频的听力损失，且高频听力损失小鼠随着周龄增加而加重；（2）miRNA不仅在神经节和感觉斑中具有较高水平，在蜗器和前庭器发育中也有一定表达。而miRNA最重要的三个成员为miR-96、miR-183、miR-182，其中miR-183家族基因表达于脊椎动物的感知觉细胞中，内耳毛细胞常见，与机械感觉的细胞功能、发育有关。章伟敏[12]在动物实验中发现，小鼠的miR-183表达变化与ROS相关，且随着月龄增长而减少，参与老年性聋的病理机制。miR-96作为miR-183家族中成员，对耳聋发作起到重要基础作用。王耀文[13]在动物实验中，发现小鼠耳蜗中miR-96表达随月龄增加而减少，在老年性聋的发病机制中起重要作用。而本次经单因素分析，听力受损者miR-96基因、miR-183基因突变率更高，主要因miRNA中任意一个基因敲出，内耳毛细胞数量减少、半规管缺陷，进而引起异常神经丘，miR-96、miR-183作为miRNA家族中主要成员，在内耳特异性表达，在耳聋发展中起到关键作用；（3）汞、镉、铅、铬、金属砷等重金属成分可在食物链的生物放大作用下，成千上万聚集，通过多种途径进入耳内，与蛋白质、酶等成分相互抵触，使其失去活性，能损伤内耳，影响听力。同时过大噪音，可导致耳膜受损，出现耳鸣、听力减退等症状。目前关于彼此作用机制尚未明确，还需日后进一步分析；（4）年龄：经单因素分析中，年龄≥40岁人群听力损伤率较高，说明年龄对听力可造成一定影响，随着年龄增长，听毛细胞逐渐停止向大脑传递声音信号，导致听力逐渐下降[14]。但本次经二元Logistic回顾分析发现年龄并不属于独立影响因素，可能是本次收治的人群大部分为中年人群，听力受损程度并不明显。

在本研究结果中，两组比较CDH23-rs3802711位点的基因频率和基因型存在统计差异，这是因为CDH23-rs3802711位点C＞T突变，导致编码产物1804位的残基精氨酸替换为谷氨酰胺，改变了原本位点的产物，导致CDH23钙结合能力下降，削弱CDH23分子和其他蛋白之间相互作用，使静纤毛更易受到噪声刺激损伤，降低细胞间的黏附功能。杨卫平等[15]通过鼠实验发现CDH23-Exon7末位G突变为A，可使听力损失的易感性增加，但本研究并未发现此现象，可能是由小鼠与人类的种属差异造成的，但第七外显子上的末位单核苷酸位点属于同义突变，可改变CDH23空间结构，影响钙结合能力和表达产物的黏附功能，导致听力损伤。本次研究结果还发现，两组末位单核苷酸位点AA、AG、GG基因型分布及A/G等位基因频率存在统计差异性。

4 结论

综上所述，CDH23基因多态性、miR-96基因、miR-183基因与NIHL存在一定相关性，对噪声性听力损伤易感性的判断具有一定价值，有助于为人们听力保护提供科学依据。