P38MAPK调控AQP2参与内淋巴积水的形成

廖行伟 任毅 黄巧 侯涛 翟思佳 尹时华

广西医科大学第二附属医院耳鼻咽喉头颈外科（南宁 530007）

梅尼埃病（Meniere's disease，MD）是一种内耳疾病，以自发性眩晕发作、低频听力丧失、耳闷堵感和耳鸣为特征。长期以来，内淋巴积水一直被认为是梅尼埃病的病理学基础[1]。在耳蜗中，内淋巴积水通常被认为是前庭膜向前庭阶扩张。

水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是参与炎症反应的细胞中作为调节水液稳态的关键蛋白[2]。在内耳的膜迷路中已经鉴定出八种AQP亚型，并且证实AQP2在外淋巴和内淋巴的体积调节中具有重要的生理作用[3]。

P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)是高度保守的丝氨酸/苏氨酸丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成员，可引发炎症反应、细胞分化凋亡、衰老及RNA剪接调控等[4]。SB203580是其特异性抑制剂[5]。在小鼠肾脏集合管细胞中发现，精氨酸加压素（AVP）通过P38MAPK途径能够改变AQP2蛋白酶体降解，增强AQP2在肾脏的表达，以维持体内水分的体内平衡[6]。醋酸去氨加压素是AVP类似物，常用于构建内淋巴积水模型。在豚鼠内淋巴积水模型研究发现，内淋巴积水与AQP2的表达上调有关[7]。基于此，本文将P38MAPK信号通路作为研究切入点，利用醋酸去氨加压素构建内淋巴积水模型，探讨P38MAPK是否通过调控AQP2参与内淋巴积水的形成。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择健康花色豚鼠，雌雄不限，体重在300g-350g之间，由广西医科大学动物实验中心提供，并排除ABR阈值大于40 dB SPL和DPOAE不通过者。

1.2 实验动物分组及给药

筛选合格豚鼠30只：空白对照组（6只）：腹腔注射生理盐水，剂量与积水组一致，连续10天；积水组（12只）：腹腔注射醋酸去氨加压素6μg/kg/d，连续10天；抑制剂组（12只）：腹腔注射醋酸去氨加压素6μg/kg/d，15min后腹腔注射SB203580 30μg/kg/d，连续10天。所有组别豚鼠在停止给药7天后行ABR和DPOAE检测，并在检测后同时取材。HE染色观察各组豚鼠内淋巴积水程度，免疫组化和qRT-PCR分别检测P-P38MAPK、AQP2蛋白和mRNA在各组豚鼠耳蜗表达情况。

1.3 听性脑干反应（ABR）阈值和畸变产物耳声发射（DPOAE）检测

以10%水合氯醛（0.5～0.6ml/100g）腹腔注射麻醉满意后对豚鼠进行ABR测试，记录电极置于额顶正中，参考电极接测试耳乳突，鼻尖接地，极间电阻小于1kΩ。click短声刺激，强度90dBSPL到0 dBSPL，衰减间隔10dB，接近阈值时，衰减间隔5 dB，带通滤波300～3000Hz，刺激速率为21次/秒，叠加1024次。以能引出可分辨Ⅱ波的最小刺激强度为反应阈值，并重复检测2次。随后进行DPOAE幅度测试，将f2/f1比率固定在1.20，刺激声强度L1=65dB SPL,L2=70dB SPL,取 2k、3k、4k、6k、8k、10k共6个频率点进行测试,记录各频率左、右耳的平均DPOAE反应幅值。

1.4 实验动物取材及玻片制备

豚鼠按40mg/kg 1%戊巴比妥钠腹腔注射深度麻醉，打开胸腔予以生理盐水进行心脏灌注，至口唇苍白后换为4%多聚甲醛继续灌注，待颈僵直后迅速断头、取出听泡后剥离耳蜗，同时取出肾组织。再将耳蜗置于4%多聚甲醛中，在4℃冰箱内固定48h。10%乙二胺四乙酸（EDTA）中脱钙1月，期间隔天更换脱钙液。将已脱钙的耳蜗于各梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，以4μm的厚度沿蜗轴切片。切片用于免疫组化及HE染色。

1.5 qRT-PCR

将各组豚鼠麻醉、灌注后迅速取出双侧耳蜗，置入RNA保存液中，在解剖显微镜下剥离蜗壳，取出膜迷路组织，迅速放入已加入300μl TRIZOL的1.5mL EP管中，用玻璃研磨棒在EP管中快速研磨碎，另加入 700μl TRIZOL，冰上放置 10min。按Trizol试剂盒说明严格操作,提取总RNA，然后将RNA溶于无酶水中，微量核酸蛋白检测仪测定RNA浓度。将mRNA反转录为cDNA，qRT-PCR检测样本p38MAPK、AQP2表达，反应条件:95℃15min，95℃ 15s，60℃ 30s，总共40个循环。以βactin为内参，每组设3个复孔，重复3次。引物序列:p38MAPK F:5'-CAGCTTCAGCAGATTATGCGT-3'，R:5'-AGCCACTGGTTCATCGTCAG-3'。AQP2F:5′-GATCGCCGTGGCCTTTGGTCT-3′；R：5′-AGGGAGCGGGCTGGATTCAT-3′β-actin F:5'-GCCAACCGTGAGAAGATGAC-3'；R:5'-AGGCATACAGGGACAGCACA-3'。

1.6 统计学分析

采用SPSS24.0和Graph Pad Priam6进行统计分析。计量资料若服从正态分布以±s表示，统计学方法两组间比较用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组内比较，若方差齐用LSD检验，若方差不齐用Dunnett’s T3检验；若不服从正态分布以M（P25，P75）表示，统计学方法采用秩和检验。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学观察及听力学检测

空白对照组豚鼠在实验全过程听力反应及活动未见明显异常；积水组和抑制剂组豚鼠在给药前后也未见有听力反应迟钝、步态不稳、畏寒畏光等行为学改变，但在给药一周后，部分豚鼠呈蜷曲状，相对于给药前活动减少；各组豚鼠给药前后ABR阈值未见明显改变,差异无统计学意义（P＞0.05，表1、图1），DPOAE检查无明显异常改变（图2）。

表1 各组豚鼠给药前后ABR阈值比较(dB SPL)（±s）Table 1 Comparison of ABR threshold before and after administration of each group of guinea pigs(dB SPL)（±s）

表1 各组豚鼠给药前后ABR阈值比较(dB SPL)（±s）Table 1 Comparison of ABR threshold before and after administration of each group of guinea pigs(dB SPL)（±s）

Groups Blank control group Hydrops group Inhibitor group F P Before administration 30.83±3.76 29.58±3.97 30.83±3.59 0.394 0.678 After administration 30.83±3.65 30.00±3.61 31.04±3.61 0.161 0.852 t 0.000 0.518 0.364 P 1.000 0.615 0.723

图1 积水组豚鼠给药前和取材当天ABR检测结果。a给药前；b取材当天。Fig.1 ABR test results of guinea pigs in the hydrops group before administration and on the day of sampling.a is before administration;b is on the day of sampling.

图2 积水组豚鼠给药前和取材当天DPOAE检测结果。a给药前；b取材当天。Fig.2 DPOAE test results of guinea pigs in the hydrops group before administration and on the day of sampling.a is before administration;b is on the day of sampling.

2.2 形态学观察

通过HE染色法观察耳蜗蜗管及前庭积水程度，计算蜗管横截面积与蜗管加前庭阶横截面积之和的比值（1/3＜R≤1/2为轻度积水，1/2＜R≤2/3为中度积水，R＞2/3为重度积水）。空白对照组6只豚鼠耳蜗切片均未见前庭膜向前庭阶膨突现象，R均小于1/3，积水率为0%；积水组12只豚鼠耳蜗切片中，9例出现膜迷路积水，积水率为75%，其中重度积水1例，中度积水2例，轻度积水6例；抑制剂组12只豚鼠耳蜗切片中，4例出现膜迷路积水，积水率为33%，其中轻度积水4例，无中、重度积水（见表2、图3）。

表2 各组豚鼠耳蜗膜迷路积水程度比较结果Table 2 Comparison of the degree of guinea pigs’cochlear hydrops in each group

图3 HE染色结果（100×）。a：正常膜迷路（空白对照组）；b：轻度积水（抑制剂组）；c：中度积水（积水组）；d：重度积水（积水组）。Fig.3 HE staining results(100×).a:No hydroponic membrane labyrinth(blank control group);b:mild hydrops(inhibitor group);c:moderate hydrops(hydrops group);d:severe water accumulation(hydrops group).

2.3 免疫组化结果

2.3.1 各组P-P38MAPK免疫组化结果

以P-P38MAPK在肾脏的表达作为阳性对照，P-P38MAPK主要表达于肾集合管；以生理盐水代替P-P38MAPK一抗作为各组实验的阴性对照，见耳蜗各部位无显色；P-P38MAPK在各组豚鼠耳蜗中均有表达，广泛表达于血管纹（StV）、螺旋韧带（SPL）、前庭膜（RM）、Corti's（OC）、螺旋缘（SLM）、螺旋神经节（SG）（图4）。方差分析结果显示：组内比较，螺旋神经节相对于其他部位表达较弱，差异有统计学意义（P＜0.01）；余部位表达无明显差异。组间比较，同一部位在不同组别表达量不同，差异具有统计学意义（P＜0.01）；三组间两两比较后发现，积水组和抑制剂组P-P38MAPK在同一部位表达相对于空白对照组都显著增强，其中积水组表达量又高于抑制剂组，差异均具有统计学意义（P＜0.01）（图5、表3）。

图4 P-P38MAPK免疫组化结果（200×）。a：P-P38MAPK主要表达于肾集合管；b：生理盐水代替P-P38MAPK一抗作为各组实验的阴性对照；c-e：广泛表达于血管纹（StV）、螺旋韧带（SPL）、前庭膜（RM）、Corti's（OC）、螺旋缘（SLM）、螺旋神经节（SG），c为积水组，d为抑制剂组，e为空白对照组。Fig.4P-P38MAPK immunohistochemistry results(200×).a:P-P38MAPK is mainly expressed in the renal collecting duct;b:Saline instead of P-P38MAPK primary antibody as the negative control of each group of experiments;c-e:P-P38MAPK is expressed in all groups of guinea pig cochlea,widely expressed in StV、SPL、RM、OC、SLM、SG,c is hydrops group,d is inhibitor group,e is blank control group.

2.3.2 各组AQP2免疫组化结果

以AQP2在肾脏的表达作为阳性对照，AQP2主要表达于肾集合管；以生理盐水代替AQP2一抗作为各组实验的阴性对照，见耳蜗各部位无显色；AQP2在各组豚鼠耳蜗中均有表达，广泛表达于血管纹、螺旋韧带、前庭膜、Corti，s器、螺旋缘、螺旋神经节（图4）。方差分析结果显示：组内比较，各部位表达无明显差异。组间比较，除螺旋神经节外，同一部位在不同组别AQP2表达量不同，差异具有统计学意义（P＜0.01）；在螺旋神经节处，各组AQP2表达量无显著差异（P=0.365）；三组间两两比较，除螺旋神经节外，积水组和抑制剂组豚鼠耳蜗AQP2在同一部位表达相对于空白对照组都显著增强，其中积水组表达量又高于抑制剂组，差异具有统计学意义（P＜0.01）（图6、表4）。

表4 各组豚鼠耳蜗不同部位AQP2蛋白表达平均光密度值（AOD）比较Table 4 Comparison of the AOD of AQP2 protein expression in different parts of the guinea pig cochlea

图6 AQP2免疫组化结果（200×）。a AQP2主要表达于肾集合管；b：以生理盐水代替AQP2一抗作为各组实验的阴性对照；AQP2广泛表达于血管纹（StV）、螺旋韧带（SPL）、前庭膜（RM）、Corti，s器（OC）、螺旋缘（SLM）、螺旋神经节（SG），c为积水组，d为抑制剂组，e为空白对照组。Fig.6 AQP2 immunohistochemistry results(200×).AQP2 is mainly expressed in the renal collecting duct;b:the saline is used instead of the primary antibody of AQP2 as the negative control for each group of experiments,and there is no color development in the cochlea;AQP2 is widely expressed in StV、SPL、RM、OC、SLM、SG,c is the hydrops group,d is the inhibitor group,and e is the blank control group.

图7 AQP2免疫组化结果（400×）。除螺旋神经节(SG)外，积水组＞抑制剂组＞空白对照组；在螺旋神经节(SG)处，各组AQP2表达量无显著差异。Fig.7 AQP2 immunohistochemistry results(400×).Except for spiral ganglion(SG),hydrops group＞ inhibitor group＞blank control group;at spiral ganglion(SG),there was no significant difference in AQP2 expression in each group.

2.4 qRT-PCR检测结果

荧光定量PCR检测P38MAPK、AQP2 mRNA表达量，方差分析结果显示，各组P38MAPK、AQP2 mRNA表达量有显著差异，差异有统计学意义（P＜0.01）；各组两两比较，和空白对照组相比，积水组和抑制剂组豚鼠耳蜗P38MAPK、AQP2 mRNA表达量都显著增强；积水组和抑制剂组相比较，积水组表达量又高于抑制剂组。以上差异均具有统计学意义（P＜0.01）。

图8 荧光定量PCR结果。a为各组P38MAPK mRNA相对表达量结果对比；b为各组AQP2 mRNA相对表达量结果对比；c、d为积水组豚鼠耳蜗样本P38MAPK、AQP2 mRNA熔解曲线；e、f为积水组豚鼠耳蜗样本P38MAPK、AQP2 mRNA扩增曲线。Fig.8 Real-time quantitative PCR results.a is the comparison of the relative expression of P38MAPK mRNA in each group;b is the comparison of the relative expression of AQP2 mRNA in each group;c and d are the melting curves of P38MAPK and AQP2 mRNA in the guinea pig cochlea samples of the hydrops group;e and f are the guinea pig cochlea of the hydrops group Sample P38MAPK,AQP2 mRNA amplification curve.

3 讨论

梅尼埃病是以反复的眩晕发作，听力波动性损失和耳鸣为特征的一种常见疾病，多数患者还伴有耳闷堵感和前庭功能进行性丧失，患者的日常生活活动和与社交互动被严重限制，长期以来，内淋巴积水一直被认为是梅尼埃病的病理学基础[1]。自从水通道被发现以来，越来越多的科学基础研究证实这些水通道蛋白在内耳液的稳态中起着至关重要的作用。内耳的水平衡部分是通过AVP-AQP2系统来调节的，而内淋巴积水作为梅尼埃病的一个形态学特征，被认为是由该系统的调节不当引起的[8]。

Sawada等在2002年发现AQP2在耳蜗和内淋巴囊中均有表达，且AQP2的表达随精氨酸加压素(AVP)水平的升高而上调[9]；Takumida等发现AQP2在大鼠耳蜗血管纹的基底细胞、上皮下组织中的II型纤维细胞、内毛细胞、螺旋神经节细胞表达较强，而在外毛细胞中表达相对较弱[10]。国内韩红蕾等学者在研究中证实AQP2表达在豚鼠血管纹、Corti’s器、螺旋神经节细胞和内淋巴囊中，且膜迷路积水后，AQP2在血管纹处的表达较正常组增强[7]。在我们的研究结果中，AQP2在各组豚鼠耳蜗中均有表达，广泛表达于血管纹、螺旋韧带、前庭膜、Corti，s器、螺旋缘、螺旋神经节；同组豚鼠耳蜗各部位表达无明显差异；这与国内外多数学者的研究结果是基本一致的。

各组豚鼠给药前后ABR阈值及DPOAE结果无明显差异，也未见有自发性眼震、听力反应迟钝、步态不稳、畏寒微光等症状和体征，虽然在给药一周后，部分豚鼠呈蜷曲状，相对于给药前活动减少，但统计结果并无统计学意义。推测因为理想的ABR阈值如果要确定为纯音听阈，首要条件是刺激声应有频率特异性，但当前ABR阈值测试常用短声，而短声声能主要分布于2k-4kHz处，故测试结果为高频听力状态，而内淋巴积水初期的听力损失多以低频听力损失为主，各组豚鼠给药前后ABR阈值无明显差异可能与此相关，后续有待进一步研究证实。

表5 各组P-P38MAPK、AQP2 mRNA相对表达量（±s）Table 5 Relative expression of P-P38MAPK and AQP2 mRNA in each group（±s）

表5 各组P-P38MAPK、AQP2 mRNA相对表达量（±s）Table 5 Relative expression of P-P38MAPK and AQP2 mRNA in each group（±s）

Groups Blank control group Hydrops group Inhibitor group F P P-P38MAPK mRNA 0.56±0.05 1.10±0.03 0.86±0.04 340.373＜0.0001 AQP2 mRNA 0.48±0.04 1.03±0.06 0.68±0.07 188.423＜0.0001

在小鼠肾脏集合管细胞中，通过p38MAPK途径能够改变AQP2蛋白酶体降解，增强AQP2在肾脏的表达[6]。在豚鼠内淋巴积水模型研究发现，内淋巴积水与AQP2的表达上调有关[3]。在本次研究过程中，我们在积水组用AVP类似物醋酸去氨加压素腹腔注射10天制造内淋巴积水模型，抑制剂组则在积水组基础上每天加用P38MAPK特异性抑制剂SB203580，另外一组腹腔注射生理盐水进行空白对照，在停药7天后行ABR及DPOAE检查后取材。

HE染色结果显示积水组和抑制剂组都呈现出不同程度的内淋巴积水，其中积水组积水率为75%，抑制剂组积水率为33%；在积水组中，PP38MAPK和AQP2表达量都明显增强，而此时内淋巴积水率也最高，并且出现中、重度积水；而在应用P38MAPK抑制剂后，P-P38MAPK和AQP2表达量与积水组相比又明显减弱，但较空白对照组还是明显增强。推断在豚鼠内耳耳蜗中，AVP-AQP2系统一旦被激活，P38MAPK也随之响应并且被大量激活磷酸化，此时AQP2的表达量也随之上升，随后内淋巴积水形成且逐渐向中、重度积水发展；而P38MAPK一旦被抑制，P-P38MAPK表达减少，AQP2的表达量也随之减少，内淋巴积水程度相对于积水组来说则明显减轻，这可能与P38MAPK被抑制后，与AQP2的正反馈调节机制减弱，同时AQP2的泛素化降解增多有关[6]。

而在空白对照组，所有豚鼠均未出现内淋巴积水，但P-P38MAPK及AQP2在耳蜗各部位还是有轻度表达，推测在正常生理状态下，P38MAPK与AQP2参与维持内淋巴液的动态平衡。

P-P38MAPK和AQP2蛋白在各组豚鼠耳蜗中均有表达，广泛表达于血管纹、螺旋韧带、前庭膜、Corti，s器、螺旋缘、螺旋神经节等部位；除螺旋神经节外，积水组和抑制剂组豚鼠耳蜗各部位P-P38MAPK和AQP2表达相对于空白对照组都显著增强，其中积水组表达量又高于抑制剂组；在螺旋神经节处，各组P-P38MAPK相对于同组其他部位表达较弱，而AQP2表达量在各组间无显著差异，合理推断内淋巴积水主要源于血管纹、螺旋韧带、前庭膜、Corti，s器、螺旋缘等处的AQP2诱导，螺旋神经节可能并不参与内淋巴积水，P38MAPK调控AQP2参与内淋巴积水的形成也主要发生在这些部位。

综上，P38MAPK可能通过调控AQP2参与内淋巴积水的形成。P38MAPK抑制剂可减轻内淋巴积水程度。