酪乳中乳脂肪球膜成分的制备工艺

徐蕴桃，刘佳袆，孙颜君，刘振民，万嗣宝

1. 乳业生物技术国家重点实验室，上海乳业生物工程技术研究中心，光明乳业股份有限公司乳业研究院（上海 200436）；2. 上海大学生命科学学院（上海 200444）

乳脂肪球膜（milk fat globule membrane，MFGM）是包裹于牛乳中脂肪球表面的三层膜结构。其富含极性脂质，如鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱等[1]。它们具有调控胆固醇代谢、抗神经退化等作用[2]。在MFGM表面镶嵌多种蛋白质，如嗜乳脂蛋白、黄嘌呤脱氢酶/氧化酶等，它们具有防止细胞衰亡、提高机体免疫力的功能[3]。将MFGM作为功能性乳成分添加到不同产品中能提高其营养价值[4]。

酪乳（Buttermilk，BM）是黄油加工的副产物，是稀奶油经搅打后稀出的水相成分[5-6]，搅打时脂肪球之间碰撞，MFGM脱落到水相。工业生产黄油时，酪乳常丢弃或用于动物饲料[7]。随着对MFGM深入了解，试验开始研究分离MFGM的方法和添加到乳制品中[8-9]。将酪乳作为分离MFGM原料，能降低成本的同时也提高附加值[10]。

Holzmuller等[11]以酪乳为原料，经凝乳酶处理后用80 nm陶瓷膜超滤，可较好地去除酪蛋白和乳清蛋白。0.1～1.4 μm的陶瓷膜、0.22 μm聚偏氟乙烯膜等膜包[12～14]已应用于MFGM的分离处理，需考察不同分离参数对分离的影响[15]。过膜压力、温度等因素影响MFGM分离效果[16-17]，非优化条件得到的MFGM膜蛋白和极性脂质损失大。膜包材料和过滤系统也很关键，如改良聚醚砜膜材和聚偏二氟乙烯膜材表现出优良通透性及低膜蛋白吸附率[18-19]。切向流过滤系统可减少富集物堆积，提高过滤效率[20]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酪乳（实验室自制）；Lacprodan®MFGM-10（阿拉）；酪乳粉（恒天然）；0.22 μm Pellicon2Mini PVDF膜包（Milipore）；100 kDa Centramate T系列PES膜包（Pall）；BeyoGel™ Plus PAGE预制胶、蛋白上样缓冲液、蛋白标准品（10～150 kDa）、考马斯亮蓝快速染液、SDS-PAGE电泳液（Tris-Gly）（上海碧云天）。柠檬酸钠、氢氧化钠、盐酸、无水氯化钙（国药集团）；凝乳酶（DANSICO）。

1.2 仪器与设备

PROTEAN3电泳仪、Geldoc-XR+凝胶成像仪（美国Bio-Rad）；CentramateTM table切向流过滤系统（Pall）；320型pH计（德国Mettler-Toledo）；Free-Zone-12L冷冻干燥机（美国Labconco）。

1.3 试验方法

1.3.1 预处理方式对分离效果的影响

1.3.1.1 凝乳酶处理法

1 kg酪乳加0.03%凝乳酶，pH 调至6.8后45 ℃水浴30～60 min，结束后将酪蛋白凝乳液搅拌破碎，静置1 h，收集上清液[11]。上清液使用100 kDa滤膜分离：过膜压力0.5 bar，温度25 ℃。超滤结束后向截留液中倒入与渗透液体积等量去离子水，并在相同分离条件下进行洗滤，重复5次，收集第1次截留液U0和经5次洗滤后的截留液U5，进行成分分析。

1.3.1.2 柠檬酸钠处理法

1 kg酪乳加2%柠檬酸钠解离，于4 ℃冷藏过夜[21]。解离液0.22 μm微滤分离，分离条件和洗滤过程同1.3.1.1小节。收集第1次截留液M0和经过5次洗滤后的截留液M5，进行成分分析。

1.3.2 洗滤次数对分离效果的影响

根据1.3.1小节成分分析结果，选择合适的预处理方式。称取预处理后酪乳500 g，过膜压力0.5 bar、温度25 ℃、料液pH 6.5过膜分离。洗滤重复8～10次，收集每次的截留液W0～W10，进行成分分析。

1.3.3 膜分离条件对分离效果的影响

取预处理后酪乳500 g，进行过膜条件优化。按过膜压力0.25，0.50，0.75，1.00和1.25 bar，分离温度5，15，25，35和45 ℃，料液pH 5，6，7，8和9，进行单因素试验。洗滤5次，最终截留液即为MFGM富集物。记录截留液质量和入料酪乳质量，计算非膜蛋白清除率。各因素各水平试验平行3次。

1.3.4 膜通量的测定

预处理后的酪乳进行膜分离，收集截留液。对截留液多次洗滤。记录每次洗滤后渗透液质量M（kg），每次过滤时长T（h），膜包的面积为A（m2），膜通量[kg/（m2·h）]按式（1）计算。

1.3.5 非膜蛋白去除率和膜蛋白保留率的测定

采用标记型SDS-PAGE电泳法[22]对入料酪乳、截留液中非膜蛋白和膜蛋白进行相对定量。用Image Lab进行凝胶条带分析。根据相对定量结果计算非膜蛋白去除率、膜蛋白保留率。结合试验记录的MBM、MMFGM及N，非膜蛋白清除率及膜蛋白保留率按式（2）和（3）计算。

式中：MBM、MMFGM为酪乳和MFGM富集物的质量（g）；NBM、NMFGM为酪乳和MFGM富集物上样稀释倍数；RCMFGM中非膜蛋白和RCBM中非膜蛋白为Image Lab分析的MFGM富集物和酪乳中非膜蛋白的相对含量（单位为1）。

1.4 数据分析和处理

采用SPSS软件进行差异显著性分析；Design-Expert.V 8.0.6进行响应面分析；Image Lab进行凝胶图灰度分析。

2 结果与分析

2.1 预处理方式对分离效果的影响

由图1蛋白电泳结果可知，酪乳经柠檬酸钠和凝乳酶沉淀处理后5次洗滤，酪蛋白和乳清蛋白显著降低，洗滤显著提高非膜蛋白去除率。经凝乳酶沉淀处理酪蛋白胶束后，酪蛋白含量显著减少，同时膜蛋白也显著减少，因为酪蛋白发生凝聚时，部分乳清蛋白和膜蛋白被包裹在酪蛋白聚合体中[15]。图2对比2种预处理方式对截留液中各类蛋白质含量的影响，经柠檬酸钠处理，0.22 μm微滤得到的MFGM富集物中酪蛋白和乳清蛋白的去除率达48.6%和64%，且MFGM膜蛋白保留率可达70%。凝乳酶处理后经100 kDa超滤得到的MFGM富集物中酪蛋白去除率接近100%，乳清蛋白去除率达60%，而膜蛋白损失较为严重，损失率达82.56%。Holzmuller等[11]采用凝乳酶处理酪蛋白后使用80 nm材质膜包超滤分离，结果显示酪蛋白、乳清蛋白去除率能达100%，各类膜蛋白损失率在20%～75%。凝乳酶处理会对膜蛋白造成无法避免的损失，优化凝乳条件后膜蛋白损失也达50%～70%[23]。

图1 柠檬酸钠解离（上）后经膜洗滤截留液和凝乳酶沉淀（下）后经膜洗滤截留液的蛋白质电泳图

图2 酪蛋白、乳清蛋白和MFGM膜蛋白保留率随分离过程的变化

2.2 洗滤次数对分离效果的影响

单次膜分离会随着浓缩倍数的增加，膜表面出现浓差极化效应[24]，膜通量达到最大值后出现急剧下降趋势，并趋于平稳[17]。单次分离膜通量低，分离效果差，无法较好去除酪蛋白和乳清蛋白。补入洗滤液稀释能使料液浓度下降，降低浓差极化效应，恢复膜通量[25]，有效改善分离效果[26]。以水为洗滤液能在低离子强度条件下增加胶体斥力，避免MFGM片段间碰撞、解体，最大限度减少MFG破损[27]。

2.2.1 洗滤次数对膜通量影响

图3中洗滤至第5次时，膜通量趋于平稳，洗滤第5次（W5）和第8次（W8）不存在显著性差异（P＞0.05）。W5和W0～W3存在显著性差异（P＜0.05）。膜通量趋于稳定是因为在经过5次洗滤后，料液中被截留的物质不断减少，并趋于稳定，加水稀释后固形物浓度趋于稳定，膜通量也趋于定值[25]。

图3 平均膜通量随洗滤次数的变化

2.2.2 洗滤次数对蛋白的影响

图4中非膜蛋白去除率随洗滤次数增加呈上升趋势，洗滤至第6次时达到最高值62.19%，之后趋于平稳，这与Jukkola等[17]的研究结果类似。乳清蛋白洗滤第1次时达较高去除率约84.05%，随洗滤次数增加，去除率保持恒定是因为部分乳清蛋白与膜蛋白或MFGM片段通过二硫键结合[28]，被保留在截留液中无法去除，洗滤至第8次乳清蛋白去除率为87.88%。试验发现增加洗滤次数带来的剪切力会使部分MFGM片段发生解体，造成MFGM上小粒径物质脱落[29]。因此洗滤次数5次较佳。

图4 洗滤次数对非膜蛋白去除率的影响

2.3 分离条件对分离效果的影响

2.3.1 过膜压力对分离效果的影响

如图5所示，非膜蛋白去除率随压力增加先上升后下降，压力0.5 bar时达最大值60.41%。一定压力范围内，过膜压力越大，膜渗透通量越高，蛋白渗透通量随之增加[17]。试验采用切向流过滤装置，压力作用方向与膜面平行，可渗透的物质靠膜上孔径拦截，料液流速过快，减少料液与膜包接触时间，造成小分子物质进入截留管道，因此去除率反而下降[20]。

图5 过膜压力对非膜蛋白去除率的影响

2.3.2 分离温度对分离效果的影响

如图6所示，非膜蛋白去除率随温度增加先上升后下降，温度35 ℃时达最大值78.21%。温度降低，料液黏度会增加，膜通量降低，造成膜部分堵塞[25]。温度适当升高，料液黏度降低，膜通透性增强。温度超过40 ℃，乳清蛋白和料液中酪蛋白或MFGM片段结合，降低发生结合作用物质的透过率，从而降低非膜蛋白去除率。同时适当增加温度能降低磷脂的膜透过率[12]，减少极性脂质损失。

图6 过膜温度对非膜蛋白去除率的影响

2.3.3 料液pH对分离效果的影响

如图7所示，pH从5～9时，非膜蛋白去除率先上升后下降，pH 7时达最大值77.07%，pH较低时，蛋白之间发生集聚，粒径增大，部分非膜蛋白无法透过膜包，减少膜通透性。pH增至碱性时，非膜蛋白去除率逐渐下降，在碱性条件下，蛋白质会发生肽键断裂或高级结构改变[30]，发生聚集沉淀。在非中性条件下，膜包和蛋白所带相反电荷会增多，增加相互排斥力。在中性条件下处于零电位，排斥力降到最小，增加了透过率[31]。Rombaut等研究发现膜分离时料液pH从4.6增至7.5，极性脂质的保留率从64%升至98%[14]，pH接近中性能降低极性脂质损失率。

图7 料液pH对非膜蛋白去除率的影响

2.3.4 响应面分析膜分离条件对分离效果的影响

2.3.4.1 试验结果

通过单因素试验，经统计学分析过膜压力、过膜温度、料液pH对非膜蛋白去除率具有显著影响，因此选取过膜压力（A）、温度（B）和料液pH（C）为自变量，以非膜蛋白去除率为响应值（T），进行响应面优化设计试验。

表1 响应面试验因素水平表

表3 响应面试验模型回归方差分析

通过Design-Expert.V 8.0.6软件对表2的试验数据进行二次多项回归拟合，二次多项回归方程为T=78.48+2.01A-0.49B-0.97C-2.19AB+0.20AC+4.63BC-4.40A2-6.71B2-0.39C2。

表2 响应面试验结果

对二次模型进行系数显著性检验及回归方差分析。结果表明，模型P=0.001 7＜0.01，表明模型差异极显著，试验方案可靠。失拟项P=0.456 5＞0.05，表明该模型不存在失拟因素，该方程具有较好的拟合性。拟合系数R2=0.939 3，该模型能描述93.93%的响应值结果，非膜蛋白去除率93.93%的变化来自于所选变量，具有代表性，可用于分离条件优化。变异系数为2.74%，模型置信度较高，能较为准确分析3个变量对酪乳得率的影响。最终确定：过膜压力0.58 bar，温度30.66 ℃，pH 6时，非膜蛋白去除率可达80.454 8%。

2.3.4.2 响应面分析

图8～图10展示任意一个因素取零水平，其余2个因素对非膜蛋白去除率的交互影响。过膜压力和温度的交互作用强于温度与pH和过膜压力与pH之间的交互作用。

图8 过膜压力与料液温度的交互影响

图9 料液pH与过膜压力的交互影响

图10 料液pH与料液温度的交互影响

2.3.4.3 条件优化验证试验

考虑试验操作性，对条件作调整：过膜压力0.6 bar，料液温度31 ℃，料液pH 6。在此条件下制备非膜蛋白去除率79.07%，与理论值相近。经优化后非膜蛋白去除率从58.82%升至79.07%，显著性提升20.25%（P＜0.05）。

2.4 自制MFGM富集物与市售产品对比

优化工艺后制备MFGM富集物并冷冻干燥，与市售BMP、市售MFGM成分对比，由表4可知，相同固形物质量的BMP中酪蛋白占蛋白含量约70%，膜蛋白占22.07%。市售MFGM中乳清蛋白含量占比较高为30.68%，酪蛋白含量显著低于其他2组（P＜0.05）。自制MFGM中乳清蛋白占比为1.39%，比市售MFGM乳清蛋白（30.68%）降低29.29%（P＜0.05）。自制中膜蛋白占比41.81%，比市售提高8.79%。自制MFGM极性脂质占固形物含量1.54%，与市售BMP（1.56%）无显著性差异（P＞0.05），与市售MFGM相比显著提高0.68%（P＜0.05），说明工艺优化后制得的MFGM中极性脂质损失较低。

表4 3种MFGM产品中各成分含量

3 结论

以黄油加工副产物酪乳为原料，并对MFGM分离纯化工艺进行优化，提高酪乳中非膜蛋白去除率，制得膜蛋白占比高，极性脂质损失少的MFGM富集物。通过对比，选择添加2%柠檬酸钠解离酪蛋白预处理酪乳，选择0.22 μm孔径的聚偏氟乙烯微滤膜包作为分离MFGM膜包材料。确定微滤洗滤次数为5次，以非膜蛋白去除率为指标优化分离条件，确定过膜压力0.6 bar、料液温度31 ℃、料液pH 6条件下制得的MFGM富集物非膜蛋白去除率为79.07%，与未优化分离条件的去除率相比提高20.25%。分离条件的优化能显著提高膜蛋白在MFGM富集物中的占比，减少非膜蛋白比例，同时保证极性脂质保留率，纯化效果较佳。