施氮对甜菜不同发育阶段根际氨基酸含量的影响

杜胜楠，潘桓艳，邢启男，张爱玲，王秋红

（黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080）

0 前言

土壤氮素是作物氮素养分的主要来源，是衡量农业土壤肥力的重要指标。由于土壤氨基酸的分布特点，是由微生物、植物与自然环境因子共同作用决定的，因此剖析土壤中氨基酸的分布特点和变化，将有利于探究土壤中氮的来源和转化，也有利于探究氨基酸对土壤的化学和物理性质的影响，从而可以进一步认识其对作物生长、生理变化的影响。由于土壤中有机氮占土地全氮的95%以上，而氨基酸态氮则是土壤有机氮的最重要成分，所以，其含量与组成将直接影响到土壤氮素的供应情况。土壤氨基酸氮大多存在在土壤有机质中的蛋白质和多肽中[1]，其含量和组成也与施肥直接相关。ALLEN等[2]用示踪法调查结果发现，施氮后，土壤腐殖质中氨基酸氮所占全氮比例明显增加。王岩等[3]的研究结果表明，残余化学氮肥有部分转变为氨基酸氮。张旭东等[4]的研究结果则指出，有机肥料也可明显提高土壤中氨基酸氮的含量。众多科学研究结果都证明，施肥使土壤中各种形态氮的含量均有了一定程度的提高，而氨基酸态氮的提高尤为突出[5-8]。这些研究结果都阐述了施肥对氨基酸总量的影响，但对氨基酸种类的影响鲜少涉及。为了适应土壤微生物代谢和植株生长发育中对含氮物质的需求，土壤氨基酸利用解聚、矿物质化等作用，来提高土壤可利用氮源[9]。因此，研究氨基酸的动态尤其是耕田土壤中不同氮处理下各氨基酸随甜菜生长变化的动态规律十分必要。本文通过研究氮肥使用后土壤氨基酸在两个基因型甜菜不同生长期中的含量变化规律，探究土壤氨基酸的长期可利用性与短期供氮潜力，为评价土壤有机氮在生态系统中氮素循环的库源作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2021年4月在黑龙江大学呼兰校区田间进行。选取黑龙江大学呼兰校区试验田为试验用土，基础土样含有机质(SOM)48.72 g/kg、碱解氮(Alkali-N)153.66 mg/kg、速效磷(Valid-P)117.76 mg/kg、速效钾(Valid-K)136.97 mg/kg、全氮(TN)2.02 g/kg、全磷[TP(P2O5)]0.157 g/kg、全 钾 [TK(K2O)]0.309 g/kg，pH 6.38[11]。试验材料选取有机氮吸收效率高、低的品种[12]各1个，分别为有机氮高效的品种‘KWS8138’和有机氮低效的品种‘Beta176’。

1.2 试验设计

1.2.1 不同氮处理 取黑土的表土10 cm，过3 mm筛。设置2个施氮处理：

（1）未施氮 N：0 mg/kg，P2O5：150 mg/kg，K2O：150 mg/kg；

（2）正常施氮N：150 mg/kg，P2O5：150 mg/kg，K2O：150 mg/kg。

表层土10 cm施肥：N用硫胺[N%=(28/132.14)×99%=20.98%]，P 用磷酸一钙[P2O5%=(142/252.08)×92%=51.82%]，K用硫酸钾[K2O%=(94/174.26)×99%=53.40%]，均用分析纯试剂。按照150 kg/hm2施肥。

3次重复，每个小框区长2 m，宽1 m；大框区长10 m，宽1 m。

用尼龙布（300目）制成直径为0.55 m的网袋，边缘穿绳收口。每个网袋装900 g的土，分别在每种处理的小框区内种植2排甜菜，共需网袋10×2=20个。

1.2.2 根际内外 选取表层0～25 cm土壤，不施氮(N：0 mg/kg，P：150 mg/kg，K：150 mg/kg)处理，混匀后，按照土壤容重1.34 g/cm3在桶中分层装入8 kg底土及12 kg网袋外土，二者成分一致，然后将网袋装入1.25 kg土后埋入桶中，于网袋上播种30粒甜菜种子，覆土150 g。每份材料12个重复。取根际和非根际土壤待测，其中根际土壤在网袋内收集，是距离活体根系表面1～2 mm以内的土壤和根表面及其黏附的土壤，非根际土是指网袋外的土壤，每份土壤3次重复。

1.2.3 取样时期 在甜菜4个时期各取4个重复。4个时期分别为：苗期、叶丛快速生长期、块根糖分积累期、收获期。

1.3 测定指标 对甜菜不同时期取到的根际和非根际土壤，采用高效液相色谱法测定氨基酸[13]：包括组氨酸(His)、丝氨酸(Ser)、精氨酸(Arg)、酪氨酸(Tyr)、甲硫氨酸(Met)、甘氨酸(Gly)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、赖氨酸(Lys)、半胱氨酸(Cys)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)等17种氨基酸各氨基酸含量，及总氨基酸(Total amino acids)含量。

2 结果与分析

在根际土壤的所有处理样品中，均检测到17种氨基酸。结果见表1、2。因此在不同处理土壤之间氨基酸的组成无变化。在所检测的17种酸解氨基酸中，以Thr、Pro、Val所占比例较大，占比皆大于10%；而Asp、Cys、Tyr、His、所占比例较低，占比皆低于3%；其余10种酸解氨基酸，如 Ser、Glu、Met、Ile、Leu、Phe、Lys、Arg、Gly和Ala居中，占比在4%～9%之间。如图1所示。

2.1 不同处理条件下根际土壤氨基酸的差异分析

2.1.1 施氮对土壤中氨基酸含量的影响 施用氮肥虽然对土壤氨基酸组成无影响，但对氨基酸含量影响较大。如表1、2所示。与未施氮处理相比，施用氮肥使氮基酸的总量明显提高。但在各种氨基酸的变化上又存在着个体差异。按照CAMPBELL等[14]的方法，将氨基酸分为4类。酸性氨基酸：Asp和Glu。中性氨基酸：Thr、Ser、Gly、Ala、Val、Ile、Leu、Tyr、Phe和Pro。碱性氨基酸：Lys、His和Arg，含硫氨基酸：Cys、Met。在4类氨基酸氮中，中性氨基酸（总量平均946.72 mg/kg），碱性氨基酸（总量平均166.75 mg/kg），含硫氨基酸（总量平均96.61 mg/kg），酸性氨基酸（总量平均91.36 mg/kg），含量依次下降，这4类氨基酸氮分别占氨基酸氮总量的72.77%、12.81%、7.42%和7.01%（图1）。

图1 施氮与未施氮条件下两个甜菜品种在不同时期各氨基酸的占比

表1 施氮对品种‘KWS8138’不同发育阶段氨基酸含量的影响 mg/kg

施氮影响最显著的是中性氨基酸（施肥平均增加91.56mg/kg），其次为碱性氨基酸（平均增加14.73mg/kg），最后是含硫氨基酸（平均增加5.83 mg/kg），酸性氨基酸（平均增加5.23 mg/kg）。

施氮处理后无论何品种何时期，17种氨基酸中总体呈现增长趋势的是：His、Arg、Glu、Thr、Ala、Pro、Cys、Lys、Asp、Ser、Gly、Met、Val、Ile、Leu、Phe。呈现下降趋势的是：Tyr。

将施氮处理土壤与不施氮土壤中的各氨基酸的含量测定结果平均后求差值，差值愈大，说明施肥影响愈明显。以此比较，施肥对检测到的17种酸解性氨基酸氯影响从大到小的顺序依次为：Thr、Gly、Ala、Pro、Val、Leu、Lys、Ser、Arg、Glu、Met、Phe、Ile、His、Cys、Tyr、Asp。其中施肥对于Tyr是负影响，于其他氨基酸是正影响。

表2 施氮对品种‘Beta176’不同发育阶段氨基酸含量的影响 mg/kg

2.1.2 甜菜品种间土壤中氨基酸含量的差异 作物的氮素吸收能力在不同氮效率基因型之间存在显著差异[11]。氮高效品种‘KWS8138’的土壤中各时期氨基酸总体含量比氮低效品种‘Beta176’高的有：Asp、Glu、Ala、Met、Arg、Lys。比其低的有：His、Thr、Pro、Cys、Ser、Gly、Val、Ile、Leu、Phe、Tyr。甜菜苗期‘KWS8138’品种根际土壤氨基酸总量高于‘Beta176’品种，平均高出22.16mg/kg，块根糖分积累期，平均高出36.58 mg/kg，收获期，平均高出18.46 mg/kg，而叶丛快速增长期‘KWS8138’品种根际土壤氨基酸总量低于‘Beta176’品种，平均低出109.08 mg/kg。

甜菜品种影响最显著的是中性氨基酸（两品种相差199.16mg/kg），其次为酸性氨基酸（相差112.36mg/kg），最后是碱性氨基酸（相差29.92 mg/kg），含硫氨基酸（相差11.92 mg/kg）。

将2个品种所有土样中的氨基酸的测定结果平均，比较2品种土壤样品中氨基酸的差值。差值愈大，说明品种的影响愈突出。以此比较，品种对检测到的17种酸解性氨基酸氯影响从大到小的顺序依次为：Glu、Thr、Pro、Ser、Val、Gly、Tyr、Lys、Arg、Leu、Ile、His、Met、Asp、Cys、Ala、Phe。

2.1.3 不同发育阶段对土壤中氨基酸含量的影响 甜菜4个时期中总氨基酸含量随甜菜生长呈上升趋势。进一步分析发现，不同种类的氨基酸在甜菜苗期、叶丛快速生长期、块根糖分积累期、收获期的含量变化动态有所不同。

在甜菜生长过程中，中性氨基酸含量随甜菜生长一直呈上升趋势，与苗期相比，叶丛快速生长期增加48.88 mg/kg，块根糖分积累期较叶丛快速生长期增加91.00mg/kg，收获期较块根糖分积累期增加15.63mg/kg。与中性氨基酸相同，碱性氨基酸含量随甜菜生长一直呈上升趋势，与苗期相比，叶丛快速生长期增加21.91 mg/kg，块根糖分积累期较叶丛快速生长期增加3.01 mg/kg，收获期较块根糖分积累期增加5.95 mg/kg，其含量在收获期显著高于其他取样时期。

酸性氨基酸的含量随甜菜生长呈先上升后下降趋势，与苗期相比，其含量在叶丛快速生长期增加了约5.77 mg/kg，于块根糖分积累期开始下降，与叶丛快速生长期相比下降7.41 mg/kg，收获期又较块根糖分积累期下降6.74 mg/kg，含硫氨基酸的比例随甜菜生长呈先下降后上升又下降趋势，与苗期相比，叶丛快速生长期下降了约4.34 mg/kg，在块根糖分积累期却上升了约14.33 mg/kg，收获期又较块根糖分积累期下降7.26 mg/kg。

2.2 根际内外土壤中氨基酸含量的差异

选取差异较大的Ser、Tyr、Ala、Gly、Arg为例进行论述，2个甜菜品种在不同时期根际内外土壤各氨基酸的占比差异如图2所示。

图2 2个甜菜品种在不同时期根际内外土壤各氨基酸的占比

2.2.1 不同发育阶段根际内外部分氨基酸含量的差异根际内外土壤中不同的氨基酸在甜菜苗期、叶丛快速生长期、块根糖分积累期、收获期的含量变化动态是不同的。各时期根际内外各氨基酸对比如表3所示。

表3 各时期根际内外各氨基酸占比 %

随着甜菜生长，根际内土壤中，Ser与Ala占比逐渐减少，Tyr占比逐渐增加，Gly占比于块根糖分积累期减少，其他时期占比无明显差异，Arg于叶丛快速生长期有所减少，块根糖分积累期占比增加，收获期又有所减少。

根际外土壤中，Ser、Ala、Arg呈下降趋势，Tyr和Gly无明显变化。

2.2.2 不同甜菜品种根际内外氨基酸含量的差异‘KWS8138’在根际内外土壤氨基酸的总含量均高于‘Beta176’，氨基酸是甜菜根系分泌物的重要成分，‘KWS8138’根系比较发达，其根系分泌物的产生量大于‘Beta176’。2个品种对于根际内外各氨基酸比例影响有所差异，如表4所示。

表4 2个品种根际内外各氨基酸占比 %

氮高效品种‘KWS8138’根际外土壤中的Ser、Tyr、Ala、Gly、Arg的占比都比氮低效品种‘Beta176’占比高。

氮高效品种‘KWS8138’根际内土壤中的Tyr、Ala、Arg的占比都比氮低效品种‘Beta176’占比高。而Ser、Gly比氮低效品种‘Beta176’占比低。

3 结论与讨论

作为土壤有机氮的重要组成部分，氨基酸在土壤氮素循环和作物营养供应过程中都有着重要功能。但土壤的施肥措施、水热条件、耕作作用等各种因素都会影响土壤中氨基酸浓度[15-19]。ALLEN等[2]用示踪法调查结果发现，施氮后，土壤腐殖质中氨基酸氮所占全氮比例明显增加。李世清[6]研究发现，施肥对土壤氨基酸含量有极显著影响。王岩等[3]的研究结果表明,残余化学氮肥有部分转变为氨基酸氮。张旭东等[4]的研究结果则指出，有机肥料也可明显提高土壤中氨基酸氮的含量。本试验结果表明，施用氮肥可以提高土壤中氨基酸含量。原因是在作物（甜菜）-土壤体系中，作为底肥施入氮肥后，部分无机氮素被作物吸收，部分可能形成固定态铵也可能被微生物利用生成氨基酸以及其他代谢产物积累在土壤中[20-23]，因此施氮处理的土壤比未施氮处理氨基酸总量高。而高出最多的是中性氨基酸(91.56 mg/kg)，其次是碱性氨基酸(14.73 mg/kg)，再次是酸性氨基酸(5.83 mg/kg)，含硫氨基酸(5.23 mg/kg)。其中Thr、Gly、Ala、Pro、Val、Leu、Lys、Ser含量提高幅度较大，皆大于50 mg/kg。甜菜幼苗时期，任何处理的土壤氨基酸含量在都很低，随着甜菜叶丛的快速生长，氨基酸含量大幅度增加，施氮和未施氮土壤的氨基酸含量持续增长，而后的块根糖分积累时期，施氮处理土壤的氨基酸含量依然比未施氮处理高。这与胡晓航[24]，研究中氨基酸态氮在甜菜生长过程中的动态变化结论相似。此现象与甜菜根系分泌物的产生与根系对有机氮的矿化有关[27,38]。作物吸收氨基酸的种类不同，加之不同种类的氨基酸与土壤矿物阳离子交换能力不同致其可利用性不同，导致中性、碱性、酸性和含硫氨基酸在土壤中的变化规律有差异。由于蛋白质须解聚成氨基酸才能被植物和微生物利用，所以氨基酸的吸附能力显著影响其生物有效性，吸附作用越强烈，氨基酸的生物可利用性越低。VINOLAS等[25]研究发现，Lys可以与土壤阳离子复合体发生交换反应，而Gly和Glu的这种能力较弱，即Lys与土壤基质的吸附能力强于Gly和Glu，从而使Gly和Glu的生物利用性强于Lys。本试验在叶丛快速生长期和块根糖分积累期甜菜需氮旺盛时期，Glu和Gly有明显降低，而Lys并无明显变化再次验证了这一观点。

对于甜菜品种对氨基酸的影响，目前有研究表明：有机氮高效品种‘KWS8138’的氨基酸态氮的含量高于低效品种‘Beta176’，低于无苗对照[11]。原因是品种‘KWS8138’的根系比品种‘Beta176’更发达，能产生更多的根系分秘物，影响微生物群落的生长，促进土壤中的有机氮矿化。从而品种‘KWS8138’比品种‘Beta176’根际土壤中能矿化出更多的氨基酸态氮[11]。其中表现最明显的是Glu，在甜菜整个生长季，‘KWS8138’品种对Glu的矿化量平均比‘Beta176’品种多出107 mg/kg。甜菜在苗期、块根糖分积累期、收获期时，‘KWS8138’品种根际土壤氨基酸总量高于‘Beta176’品种，只有在叶丛快速生长期时，‘KWS8138’品种根际土壤氨基酸总量低于‘Beta176’品种。这或许是由于甜菜在叶丛快速生长期生长快速，需氮量大，而氨基酸态氮为甜菜作物的根系可以直接吸收利用的氮素营养，被直接吸收利用。

所取样本中根际土壤是距离活体根系表面1～2 mm以内的土壤和根表面及其黏附的土壤，是在网袋内收集，而非根际土是指网袋外的土壤。在无施肥土壤条件下，所测根际内外土壤各氨基酸占比对比。甜菜生长对根际土壤氨基酸占比影响较显著，对根际外土壤氨基酸影响并不显著。这应该与作物的根系养分输送特征有关。作物通过细的根毛细胞吸收生长所需营养元素[26]。而甜菜根系几乎都在网袋内，只有极少量根系能穿过网袋伸入网袋外的非根际土中。所以网袋内根际土中的氨基酸易被甜菜根际吸收，而网袋外的氨基酸只能通过渗透作用进入网袋被甜菜吸收利用,或被微生物利用。根际内土壤中Ser、Ala、Arg、Tyr和Gly的占比随着甜菜生长不断改变，这与甜菜根系分泌物的产生[27]、矿化作用和甜菜生长过程中会吸收氨基酸为氮源以供生长有关[28-31]。而根际外土壤中，Ser、Ala、Arg呈一直下降趋势，而根际内这3种氨基酸也是呈下降趋势的，可能是由于甜菜生长对这3种氨基酸需求量大，或这3种通过矿化作用转化成无机氮或其他形式的氮素供应植物和微生物的需求[32-38]。根际内土壤中的这3种氨基酸被利用后，根际外土壤由于渗透作用对这3种氨基酸进行补充，从而造成根际外土壤这3种氨基酸含量下降。

有研究表明：有机氮吸收高效的品种‘KWS8138’根际土壤中的氨基酸含量均高于低效品种‘Beta176’，这是由于‘KWS8138’根系比较发达，其根际的根系分秘物会大量产生，通过化感作用，影响微生物群落的生长，这一交互作用可促进土壤中的有机氮矿化[39]。所以根际外无根直接接触的土壤里由于渗透作用，根际土中氨基酸渗透到根际外土壤。导致氮高效品种‘KWS8138’根际外土壤中的Ser、Tyr、Ala、Gly、Arg的占比都比氮低效品种‘Beta176’占比高。而Ser、Gly比氮低效品种‘Beta176’占比低，可能是由于这两种氨基酸被甜菜吸收利用，或通过矿化作用转化成无机氮或其他形式的氮素，而被消耗了。

综上所述，土壤中的氨基酸氮具有生物可利用性，而氨基酸氮又是土壤有机氮矿化后的主要产物，甜菜根系可产生根系分泌物，氨基酸是根系分泌物的重要成分。从而在甜菜生长期间其含量不断发生动态变化。总体来说，甜菜4个时期中总氨基酸含量随甜菜生长呈上升趋势，但各氨基酸的矿化量与生物可利用性不同，加之作物吸收氨基酸的种类不同，所以各种氨基酸的变化上又存在着差异。4个时期中施肥处理的土壤与未施肥土壤相比，施肥处理的土壤中氨基酸氮总量高于未施肥处理。其中高出增幅最大的是中性氨基酸。施氮肥增加了土壤氨基酸氮的含量，从而提高了土壤持续供氮能力。氮高效品种‘KWS8138’对氨基酸的矿化量高于氮低效品种‘Beta176’，根际土壤氨基酸占比受到甜菜生长的显著影响，根际外土壤氨基酸变化并不显著。根际土壤氨基酸含量变化大于根际外土壤。