基于网络药理学与分子对接技术的乳癖散结胶囊治疗浆细胞性乳腺炎的潜在分子机制研究

徐政杰 方 堃 姜苏晓 段丽娟 毛春花 张 萍

银川市妇幼保健院外科，宁夏银川 750001

浆细胞性乳腺炎（plasma cell mastitis，PCM）以乳腺导管阻塞、导管继发性扩张、肉芽组织增生、淋巴细胞浸润为主要病理学特征[1-3]。近年来，PCM 发病率逐渐增加，早期多以药物治疗为主[3-4]。PCM 发病机制复杂，明确的药效靶点不多，临床缺乏疗效肯定的西药。随着治疗模式的转变和用药经验的积累，人们已经认识到中医药治疗PCM 的临床价值，并进行了诸多探索[5-7]。

中药复方乳癖散结胶囊活血化瘀、通络止痛、清热解毒，广泛用于乳腺增生等的治疗[8-10]，且可调节激素水平[11]，治疗PCM 具有较高价值。但该复方所含有效成分复杂，治疗PCM 的相关机制尚未明晰。网络药理学运用生物分子网络方法分析药物与疾病和靶点之间“多成分、多靶点、多途径”协同作用关系的药理学分支，与中医药治疗复杂疾病的原则一致[12-13]。本文采用该法探讨乳癖散结胶囊治疗PCM 的潜在化学成分及可能机制。

1 资料与方法

1.1 预测药物有效成分筛选及靶点

在中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）和中药分子机制生物信息学分析工具（bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine，BATMANTCM）检索夏枯草、川芎、鳖甲、僵蚕、玫瑰花、赤芍、柴胡、当归、莪术、牡蛎、延胡索的化学成分，根据口服生物利用度≥30%、化合物类药性≥0.18 筛选活性成分，收集相应靶点；通过通用蛋白质数据库（universal protein database，Uniprot）对已筛选的靶点进行标准化处理，转化为基因名称。

1.2 预测浆细胞性乳腺炎治疗靶点

通过在线人类孟德尔遗传数据库（online mendelian inheritance in man，OMIM）和GeneCards 数据库检索PCM 相关的治疗靶点，汇总、去重后获得。

1.3 乳癖散结胶囊治疗PCM 的靶点预测

运用Draw Venny Diagram 在线软件，取PCM 治疗靶点与“1.1”收集到的靶点取交集后获得。

1.4 构建药物-成分-靶点-疾病网络

运用Cytoscape 3.8.2 软件构建药物-成分-靶点-疾病网络。

1.5 构建蛋白质-蛋白质相互作用网络

利用STRING 数据库，设置信度为0.4，筛选乳癖散结胶囊治疗PCM 靶点之间的相互作用关系；提取关键基因连接度蛋白统计条图（选取排序前30 的），根据度值的排序确定核心靶点。

1.6 基因本体（gene ontology，GO）分子功能和京都基因和基因组数据库（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析

利用R 语言3.6.1 进行GO 富集分析，获得条图（只展示前20 条）；进行KEGG 富集分析，获得条图（只展示前20 条）。

1.7 分子对接

通过TCMSP 及PubChem 数据库得到乳癖散结胶囊成分的3D 结构信息，通过蛋白质数据库下载靶蛋白的3D 结构，Autodock Tool 4.0 软件对小分子和靶蛋白进行加氢、去电荷等处理，借助PyMOL 2.3.4 软件插件找到对接活性位点，Autodock Vina 1.1.2 软件处理后的成分与靶蛋白进行分子对接，通过PyMOL 2.3.4 软件对结果进行可视化[14]。

2 结果

2.1 乳癖散结胶囊有效成分筛选及靶点预测

TCMSP 数据库预测乳癖散结胶囊11 种有效成分中的40 个药效成分，共得到321 个靶点；OMIM 和GeneCards 数据库得到PCM 的治疗靶点498 个，取交集得到36 个乳癖散结胶囊治疗PCM 的靶点。见图1。

图1 乳癖散结胶囊治疗PCM 靶点筛选

2.2 药物-成分-靶点-疾病网络

运用Cytoscape 3.7.1 软件构建“药物-成分-靶点-疾病网络”。见图2。

图2 药物-成分-靶点-疾病网络

2.3 蛋白质-蛋白质相互作用网络

通过STRING 数据库分析得到227 对蛋白互作关系，涉及36 个蛋白靶点，见图3。提取排名前30 的关键基因连接度蛋白统计条图，见图4，其中白介素-6（interleukin-6，IL-6）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EFGR）、白蛋白（albumin，ALB）、IL-1B、B 淋巴细胞瘤-2L1（B-cell lymphoma 2L1、BCL2L1）、趋化因子（C-C 基元）配体2[chemokine（C-C motif）ligand 2，CCL2]、过氧化氢酶（catalase，CAT）的度值排名较靠前。

图3 乳癖散结胶囊治疗浆细胞性乳腺炎靶点间蛋白互作关系

图4 蛋白质-蛋白质相互作用网络节点度值排序

2.4 KEGG 与GO 富集分析

对上述36 个潜在靶点基因的KEGG 通路富集分析表明，P 值排名前20 的通路主要涉及核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、IL-17、Toll 样受体、T 辅助细胞17（T helper cells 17，Th17）分化、丝分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等信号通路。GO 富集分析提示，乳癖散结胶囊治疗PCM 所调控的分子功能主要涉及调控细胞因子、抗氧化、蛋白磷酸酶结合、跨膜受体蛋白激酶、细胞因子受体结合等方面。见图5～6。

图5 乳癖散结胶囊治疗PCM 的潜在靶点KEGG 通路富集

2.5 分子对接

选取“2.3”中乳癖散结胶囊核心成分自由度>10的有效成分，分别进行分子对接验证，显示与BAX、BCL2、PGR 具有最强结合能力的分别为luteolin（-8.2 kcal/mol）、Quercetin 和luteolin（-7.3 kcal/mol）、luteolin（9.5 kcal/mol）（图7）。据此推测乳癖散结胶囊的活性成分通过影响乳腺导管上皮凋亡及孕激素受体调节等发挥对PCM的治疗作用。

图6 乳癖散结胶囊治疗PCM 的潜在靶点的GO 通路富集

图7 乳癖散结胶囊核心成分治疗PCM 的分子对接图

3 讨论

中医临床上内治PCM，以疏郁散结为本，清热解毒为辅[15]。乳癖散结胶囊由柴胡、当归、川芎、鳖甲等药物组成，功能软坚散结、行气活血[10]。本研究筛选40 个药效成分，共预测321 个药效靶点和498 个PCM的潜在治疗靶点。本研究提示，IL-6、EFGR、ALB、IL-1B、BCL2L1、CCL2、CAT 为蛋白质-蛋白质相互作用网络的核心靶点。药物-成分-靶点-疾病网络表明，PCM治疗靶点较多，且靶点间存在着复杂作用关系，推测复方有效成分间存在协同关系。

GO 富集分析显示，上述靶点基因通过调控细胞因子活性、抗氧化活性、蛋白磷酸酶结合、跨膜受体蛋白激酶活性、细胞因子受体结合等发挥治疗PCM的潜在作用。目前，认为PCM 发病与自身免疫有关，乳房外伤、炎症、哺乳障碍、内分泌失调等引起乳腺导管引流不畅，管腔纤维组织增生，周围组织抗原反应、浆细胞浸润[16-18]。付嘉等[19]证实PCM 患者外周血中调节性T 细胞CD4+CD25+CD127-Treg 明显下降。张少波等[20]发现PCM 的发生、发展与Th17 细胞功能紊乱及重新分布有关。孙厚启[21]证实，PCM 患者机体细胞因子IL-2 处于优势状态，而IL-4 处于劣势状态，这些研究都提示细胞因子活性在PCM 损伤中所发挥的重要作用。乳癖散结胶囊的36 个潜在靶点具有调控细胞因子活性的作用，其核心靶点中IL-6 已被证实为信号转导子和转录激活子3（transcriptional activa tor，STAT3）的有效激活剂，PCM 患者IL-6 显著高表达，且IL-6/STAT3 信号通路被激活[22-23]，提示乳癖散结胶囊可能通过调控IL-6 来发挥对PCM 的抗炎治疗作用。

KEGG 通路富集分析显示，乳癖散结胶囊发挥作用与多条信号通路有关，主要涉及NF-κB、IL-17、Toll 样受体、MAPK 等信号通路。NF-κB 通路可能是促进浆细胞性乳腺炎炎症损伤的因素之一，反过来可能会触发炎症反应并在乳房中形成肉芽肿[24-25]。分析潜在治疗靶点，发现NF-κB 为显著富集通路，提示乳癖散结胶囊通过作用于NF-κB 通路进行PCM 治疗的潜在性。需指出的是，由于筛选条件的限制，本文仅分析了乳癖散结胶囊中说明书所公布的主要化合物，因此研究结果可能具有一定局限性。