lncRNA SUMO1P3诱导肝癌HepG2细胞对索拉菲尼耐药的分子机制

张生，熊万成，苗志钊，周兵（新乡医学院 第一附属医院.肝胆胰脾外科；.普外科，河南 卫辉 453100）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常见的恶性肿瘤之一，具有极高的复发率和病死率[1]。据统计，2020年全球新增HCC患者约907万，新增死亡人数约830万，其病死率目前仅次于肺癌和结直肠癌，位居全球第三位[2]；中国HCC 的病死率仅次于肺癌，其发病率位居第五位，HCC发病率与病死率均远超世界平均水平，全球新发病例和死亡病例有一半在中国[3]。尽管手术治疗、肝移植和药物治疗改善了HCC的临床疗效，但由于其高复发率和耐药性，无法阻止疾病进展[4]。索拉非尼（sorafenib，SR）是首个获批的全身用药，可使部分晚期HCC患者显著获益，然而，大多数患者会产生耐药，导致预后不良。因此，迫切需要阐明HCC 对SR 耐药的机制并寻找新的分子靶点。非编码RNA是一类无蛋白质编码功能的核酸序列[5]。研究结果[6]表明，长链非编码RNA（lncRNA）在多种肿瘤中异常表达，发挥癌基因或抑癌基因功能参与肿瘤的发生与发展。一些miRNA和lncRNA 的失调与HCC 耐药发生有着密切的联系[7-9]。研究[10-26]发现，lncRNA 小泛素样修饰蛋白1假基因3（small ubiquitin-like modifier 1 pseudogene 3，SUMO1P3）在多种肿瘤组织和细胞中高表达并发挥致癌作用，但是其在HCC的SR耐药中的作用机制尚不明确。本研究通过观察SUMO1P3 对HCC 细胞HepG2及其SR耐药细胞HepG2/SR增殖、凋亡、迁移与侵袭的影响，探讨其发挥作用的分子机制，为抵抗HCC的SR耐药提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂

肝癌细胞HepG2购自上海中乔新舟生物科技有限公司。WB 配胶试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒、总RNA 提取试剂盒、CCK-8 试剂盒、BeyoFastTMSYBR Green One-Step qPCR试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司，SR 购自SIGMA 公司，qPCR 试剂盒-SYBR Green I染料购自生工生物工程（上海）股份有限公司，细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD 公司，cyclin D1、Bcl2、BAX、MMP-2、MMP-9 和GAPDH 一抗以及HRP标记的山羊抗鼠和山羊抗兔的二抗均购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.2 SR耐药细胞HepG2/SR的构建

HepG2 细胞在含10%FBS 的DMEM 培养基中培养。在HepG2 细胞培养液中持续加入SR，其起始浓度为0.01 μmol/L，传3 代后将SR 浓度由低至高逐渐提高至5 μmol/L，最终使培养细胞在含SR 浓度为5 μmol/L的培养液中稳定传代生长，即构建成功人HCC 耐药细胞HepG2/SR。

1.3 CCK-8法检测HepG2和HepG2/SR细胞的耐药性

将HepG2 和HepG2/SR 细胞经胰酶消化、计数后，接种于96 孔板[（2×104个细胞/孔）中，待细胞贴壁后，加入不同浓度的SR 进行培养（第1孔浓度为51.2 μmol/L，倍比稀释至第9孔，第10 孔（空白对照细胞）只加入0.25%DMSO]，每组设3 个复孔。培养箱培养48 h 后弃去96 孔板的培养基，每孔加入90 μL DMEM培养基和10 μL CCK-8试剂，于细胞培养箱中处理1 h后，用酶标仪检测450 nm波长处各孔的光密度（D）值，计算细胞的存活率[细胞存活率=（加药细胞D/空白对照细胞D）×100%]。

1.4 细胞培养、转染与SR处理

将HepG2 和HepG2/SR 细胞分别接种在6 孔板（2×105个/孔）中，在含10%FBS的DMEM培养基中培养。待每孔的细胞汇合度达50%左右时，按照Lipofectamine 2000的使用说明，在HepG2/SR细胞中转染si-SUMO1P3 或si-NC，72 h 后收集细胞进行后续试验；在HepG2细胞中转染SUMO1P3过表达载体（pc-SUMO1P3）或空载体（pc-DNA），待细胞的汇合度达70%～80%时，加入5 μmol/L SR 继续培养，24 h后收集细胞，进行后续试验。

1.5 qPCR 法检测HepG2 和HepG2/SR细胞中SUMO1P3的表达水平

收集转染或处理后的各组细胞，用TRIzol提取细胞中总RNA，利用BeyoFastTMSYBR Green One-Step qPCR试剂盒进行后续实验。依照逆转录试剂盒说明书配置好反应体系后，按照设置反应温度为50 ℃，逆转录30 min，获取cDNA作为反应模板，随后进行qPCR反应。引物序列：SUMO1P3上游为5′-ACTGGG AATGGAGGAAGA-3′，下游为5′-TGAGAAAGGATT GAGGGAAAAG-3′；GAPDH 上游为5′-GTCAGCCGC ATCTTCTTTTG-3′，下游为5′-GCGCCCAATACG ACCAAATC-3′。反应条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火/延伸30 s，共40个循环。采用2−ΔΔCt法计算SUMO1P3的相对表达量。

1.6 CCK-8法检测HepG2和HepG2/SR细胞的增殖能力

将转染或处理后的各组细胞接种在96孔板中（5×103个细胞/孔）上，分别在培养0、24、48和72 h时，在每孔中加入10 μL CCK-8溶液，继续培养2 h后，使用酶标仪检测450 nm 波长处各孔的D值，根据D值绘制细胞的增殖曲线。

1.7 Transwell 实验检测HepG2 和HepG2/SR 细胞的迁移和侵袭能力

用Transwell小室法进行细胞迁移和侵袭实验。细胞迁移实验：收集转染或处理后的各组细胞，用无血清培养基制备密度为1×105个/mL 的单细胞悬液，向Transwell小室上室中加入100µL悬液，下室中加入600µL含10%FBS的培养基作为诱导剂，培养24 h后，取出上室，用4%甲醛溶液固定10 min，随后用0.1%结晶紫染色5 min，PBS清洗后，用棉签轻轻擦除上室内壁的细胞，置于显微镜下观察并拍照，随机选取5个视野，计算穿膜细胞数。细胞侵袭实验：需预先在Transwell小室上膜预铺人工基质胶，其他步骤同细胞迁移实验。

1.8 FCM检测HepG2和HepG2/SR细胞的凋亡水平

收集转染或处理后的各组细胞，分别用PI 单染色法和Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法进行凋亡检测。PI单染色法：根据试剂盒说明书方法，将收集的细胞重悬于100µL结合缓冲液中，分别加入5µL PI染色液，室温下避光处理15 min后，加入0.9 mL结合缓冲液，迅速上流式细胞仪进行检测，并用CellQuest 软件采集、分析各组凋亡细胞的比例。Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法：将收集的细胞重悬于100µL结合缓冲液中，分别加入5µL Annexin Ⅴ-FITC 染色液和5µL PI 染色液，室温下避光处理15 min后，加入0.9 mL结合缓冲液，迅速上机检测，并用CellQuest 软件采集、分析各组凋亡细胞的比例。

1.9 WB 法检测HepG2 和HepG2/SR 细胞中相关蛋白的表达

各组细胞经转染或处理后，在培养板各孔中加入适量RIPA中性裂解液，置于冰上裂解3 min后收集细胞，经低温超声和离心后，取上清液进行蛋白定量。蛋白样品经BCA法检测浓度后，加入SDS上样缓冲液煮沸，使蛋白变性。取20 μg蛋白样品，进行10%SDSPAGE，用湿转法将蛋白质转移到NC膜上，在5%TBST脱脂奶粉溶液中封闭1 h，PBS 洗膜3次（5 min/次）。加入均以1∶1000稀释的cyclinD1、Bcl2、BAX、MMP-2和MMP-9一抗，4 ℃过夜。PBS洗膜3次后，加入HRP标记的二抗（1∶2 000），37 ℃下处理1 h。PBS洗膜后，采用化学发光发法显影。以GAPDH为内参照，用ImageJ软件分析蛋白条带的灰度值。

1.10 统计学处理

qPCR 法、CCK-8 法、Transwell 实验、FCM 和WB法等实验均重复3 次。采用GraphPad 8.0 软件进行数据分析和绘图，符合正态分布的计量资料以xˉ±s表示，两组间数据比较采用t检验，以P<0.05或P<0.01表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 构建的HepG2/SR细胞高表达SUMO1P3

通过逐渐提高培养基中SR浓度的方法成功构建SR耐药细胞HepG2/SR。CCK-8法检测结果（图1A）显示，经不同浓度的SR处理后，HepG2/SR细胞对SR的耐受性显著高于HepG2 细胞（t=5.612、16.630、9.432、48.500、31.770、13.410、10.460、13.220、16.200，均P<0.01）。SR 对HepG2 细胞的半抑制浓度（IC50）为4.40 μmol/L，显著低于SR对HepG2/SR细胞的IC50（57.73 μmol/L），表明SR 耐药细胞HepG2/SR 构建成功。qPCR 法检测结果（图1B）显示，HepG2/SR 细胞中SUMO1P3 的表达水平显著高于HepG2 细胞（t=36.370，P<0.01）。结果表明，HepG2 细胞获得耐药性后，SUMO1P3 的表达水平也随之升高。

2.2 转染si-SUMO1P3 显著抑制HepG2/SR 细胞的增殖能力并诱导细胞凋亡

转染si-SUMO1P3后，与si-NC组比较：（1）si-SUMO1P3 组HepG2/SR细胞中SUMO1P3的表达水平显著下降（t=36.370，P<0.01；图2A）；（2）si-SUMO1P3组HepG2/SR 细胞在1～4 d 的增殖能力均显著下降（t=7.057、5.241、4.683、5.757，均P<0.01；图2B）；（3）si-SUMO1P3 组HepG2/SR细胞中PI阳性细胞比例显著上升（t=10.200，P<0.01；图2C，D）；（4）si-SUMO1P3 组HepG2/SR 细胞凋亡率显著升高（t=22.89，P<0.01；图2E、F）。结果表明，敲减SUMO1P3可显著降低HepG2/SR 细胞的增殖能力，并诱导细胞凋亡和坏死。

2.3 敲减SUMO1P3 可显著抑制HepG2/SR 细胞的迁移和侵袭能力

Transwell实验结果（图3）显示，与si-NC组相比，si-SUMO1P3组HepG2/SR细胞的迁移和侵袭能力均明显降低（t=5.135、7.220，均P<0.01）。结果表明，敲减SUMO1P3可显著降低HepG2/SR细胞的迁移和侵袭能力。

2.4 转染pc-SUMO1P3通过促进细胞增殖并抑制凋亡诱导HepG2细胞SR耐药

qPCR 实验结果（图4A）显示，与pc-DNA 组相比，pc-SUMO1P3 组HepG2 细胞中SUMO1P3 表达显著升高（t=5.990，P<0.01）；经5 μmol/L SR 处理后，与pc-DNA+SR 组相比，pc-SUMO1P3+SR组HepG2 细胞中SUMO1P3 的表达仍显著高升高（t=14.410，P<0.01）。

CCK-8 法检测结果（图4B）表明，与pc-DNA组相比，pc-SUMO1P3 组HepG2 细胞在转染后第2～4 天的增殖能力均显著增强（t=3.259、4.131、4.155，P<0.05 或P<0.01）；经5 μmol/L SR处理后，与pc-DNA+SR组相比，pc-SUMO1P3+SR 组HepG2 细胞增殖能力在第1～4天均显著升高（t=6.587、3.100、5.295、4.330，P<0.05或P<0.01）。

FCM 检测结果（图4C、D）显示，与pc-DNA 组相比，pc-SUMO1P3 组PI 阳性的HepG2 细胞比例显著下降（t=6.124，P<0.01）；经5 μmol/L SR 处理后，与pc-DNA+SR组相比，pc-SUMO1P3+SR组PI阳性细胞比例仍显著降低（t=6.124，P<0.01）。Annexin Ⅴ-FITC/PI双染FCM 检测结果（图4E、F）显示，与pc-DNA组相比，pc-SUMO1P3 组HepG2 细胞凋亡率显著降低（t=8.911，P<0.01）。经5 μmol/L SR 处理后，与pc-DNA+SR 组相比，pc-SUMO1P3+SR 组HepG2 细胞凋亡率仍显著降低（t=3.576，P<0.01）。

上述实验结果表明，过表达SUMO1P3 可使HepG2 细胞的增殖能力和抗凋亡能力显著增强，同时也增强了HepG2 细胞对SR 的耐受性。SUMO1P3通过增强HepG2 细胞对SR 的耐受性促进细胞增殖和抑制凋亡。

2.5 上调SUMO1P3 可通过促进细胞迁移和侵袭并诱导HepG2细胞SR耐药

Transwell 实验结果（图5）显示，与pc-DNA 组相比，pc-SUMO1P3组HepG2细胞的迁移和侵袭能力均显著升高（t=7.462、10.73，均P<0.01）；经5 μmol/L SR处理后，与pc-DNA+SR 组相比，pc-SUMO1P3+SR 组HepG2 细胞的迁移和侵袭细胞数仍显著升高（t=9.052、7.112，均P<0.01）。结果表明，上调SUMO1P3 可显著增强HepG2 细胞的迁移和侵袭能力，同时也增强了HepG2 细胞对SR 的耐受性。SUMO1P3通过增强HepG2细胞对SR的耐受性来促进细胞的迁移和侵袭。

2.6 SUMO1P3 通过调节细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭相关信号通路诱导HepG2细胞对SR的耐药

WB 法检测结果（图6）显示，敲减SUMO1P3后，与si-NC 组相比，si-SUMO1P3 组HepG2/SR 细胞中cyclin D1、Bcl2、MMP-2 和MMP-9 的表达水平均显著降低（t=7.976、6.989、4.960、3.580，P<0.05 或P<0.01），而BAX 的表达水平显著升高（t=3.830，P<0.05）。过表达SUMO1P3后，与pc-DNA 组相比，pc-SUMO1P3 组HepG2 细胞中cyclin D1、Bcl2、MMP-2 和MMP-9 的表达水平均显著升高（t=4.416、7.513、7.342、9.546，P<0.05 或P<0.01），而BAX 的表达水平显著降低（t=9.143，P<0.01）。经5 μmol/L SR处理后，与pc-RNA+SR 组相比，pc-SUMO1P3+SR 组HepG2 细胞中cyclin D1、Bcl2、MMP-2 和MMP-9蛋白的表达水平显著升高（t=4.750、3.720、14.710、6.178，P<0.05或P<0.01），而BAX的表达水平显著降低（t=9.323，P<0.01）。结果表明，SUMO1P3 通过调控细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭相关信号通路来诱导HepG2细胞对SR的耐药。

3 讨论

SUMO1P3 是SUMO1 假基因家族中的一种lncRNA，已被证实参与多种肿瘤发生的病理过程。SUMO1P3 最初在胃癌中发现表达上调[13]，后续研究结果证实，SUMO1P3 在非小细胞肺癌[25]、膀胱癌[23]、胶质瘤[10,16]、胰腺癌[19]、结直肠癌[24]以及HCC[12,20,22,26]中均表达上调。SUMO1P3在胃癌组织中高表达，可能是一种潜在的预后因素和胃癌的治疗靶点[21]。敲减SUMO1P3后，膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力均受到抑制，凋亡细胞率升高[23]。ZHOU等[26]的研究结果表明，敲减SUMO1P3 可增强HCC 的放疗敏感性；HU 等[12]通过细胞实验和小鼠荷瘤试验证实，SUMO1P3 促进HCC 的发生与发展；其他研究[20,22]同样证实，SUMO1P3可作为HCC的生物标志物。本研究聚焦SUMO1P3 在HCC 对SR 耐药中的作用，探讨HCC细胞SR耐药的分子机制。

本研究首先成功构建了HCC 的SR 耐药细胞HepG2/SR，发现HepG2/SR 细胞中SUMO1P3 表达水平显著高于HepG2细胞。据此推测，SUMO1P3的表达与HCC细胞的耐药性密切相关。肿瘤耐药发生的一个重要原因是肿瘤细胞增殖信号的过度活化。通过转染si-SUMO1P3 敲减SUMO1P3 的表达，评价SUMO1P3 表达对HCC 的SR 耐药细胞HepG2/SR 的影响，与在其他肿瘤研究[23-24,26]中的结果一致，本研究中敲减SUMO1P3显著抑制了HepG2/SR细胞的增殖能力，并促进其凋亡，表明SUMO1P3 同样影响HepG2/SR 细胞的增殖和凋亡，并通过干预其增殖和凋亡相关进程影响细胞对SR的耐药。此外，本研究通过转染pc-SUMO1P3上调HepG2细胞中SUMO1P3的表达，利用SR 进行干预，反向评价其对该细胞SR的耐受性。结果显示，SUMO1P3 表达上调后，SR 对其增殖的抑制和凋亡的促进作用均减弱，表明SUMO1P3能够降低细胞对SR的敏感性。

肿瘤转移是导致其化疗抵抗发生的另一个主要原因[27-29]。本研究结果显示，敲减SUMO1P3后，HepG2/SR 细胞的迁移与侵袭能力均显著降低；过表达SUMO1P3后，HepG2细胞的迁移和侵袭能力显著增强；同时在SR 的作用下，转染pc-SUMO1P3 的HepG2 细胞的迁移与侵袭能力显著高于对照组的HepG2 细胞。实验结果表明，SUMO1P3 通过增强HCC细胞SR耐药来增强细胞的迁移和侵袭能力。

此外，SUMO1P3 在乳腺癌[15]、HCC[20]、非小细胞肺癌[25]中都通过竞争性结合不同类型的miRNA发挥致癌作用。如LIU 等[15]的研究结果表明，SUMO1P3能够通过负向调节miR-320 促进乳腺癌的发生；WU 等[20]的研究结果表明，SUMO1P3 能够通过靶向结合miR-320a 而活化Wnt/β-catenin 信号通路，进而促进HCC 细胞增殖与侵袭；ZHANG 等[25]研究表明，SUMO1P3能够竞争性吸附miR-136进而调节非小细胞肺癌的迁移与侵袭。在本研究初步探讨了SUMO1P3 影响HCC 细胞SR 耐药的分子机制，结果发现，敲减SUMO1P3 的HepG2/SR 细胞中细胞周期相关蛋白cyclin D1、凋亡抑制分子Bcl2、迁移与侵袭相关分子MMP-2和MMP-9表达均显著降低，而促凋亡分子BAX 的表达显著升高，这与HU 等[12]的SUMO1P3 在MHCC97H 和HepG2 细胞中的分子机制类似。与之相反，在SR的作用下，与对照组相比，上调SUMO1P3的HepG2细胞中cyclin D1、Bcl2、MMP-2和MMP-9蛋白表达显著升高，BAX表达显著降低。实验表明，SUMO1P3通过影响HCC细胞的周期、凋亡、迁移与侵袭相关的分子表达诱导细胞的SR耐药。

综上所述，SUMO1P3 能够促进HCC 细胞增殖、迁移与侵袭，抑制细胞凋亡，并通过调控细胞周期、凋亡、迁移与侵袭相关的分子表达诱导细胞的SR耐药的发生，为阐明HCC细胞SR耐药发生的分子机制提供了新的思路，同时为治疗晚期HCC患者SR耐药提供了新的靶点。