草本观赏植物组织培养中常见问题分析

刘晓红,张莹杰

(太原学院 艺术设计系,山西 太原 030032)

0 引言

植物组织培养是以植物细胞具有全能性这一原理为基础,在人为创造的无菌环境下，将从植物体中分离得到的各种器官、组织、细胞等外植体材料，接种到人为提供适合其生长的培养基中，从而获得新的组织、细胞或个体的技术[1]。在100多年的发展历史中,已经有100余科1 000余种植物可以通过植物组织培养技术进行离体快繁[2]。此外,植物组织培养技术在良种快繁、作物改良、种质保存等领域发挥着很大的作用。草本观赏植物如石竹、兰花等[3]通过组织培养进行快速繁殖或脱毒培育而达到商品化生产;吊兰、菊花等[4]通过单倍体育种获得新型品种。然而在快速发展的同时,组织培养过程中也存在着一些一直无法忽略和攻克的技术难题,即褐化、玻璃化和菌类污染。三大难题的出现导致外植体材料生长异常甚至死亡,严重限制了繁殖速度,使其无法进行规模化生产,甚至直接决定了一些植物组织培养的成功与否[5]。

1 褐化现象

褐化指的是外植体材料在离体组织培养的过程中,从组织切口释放使培养基变成褐色物质,导致外植体也随之失绿变褐直至死亡的现象[6]。

学者们普遍认为组织培养过程中外植体褐变主要是由于酶促褐变引起的[7]。由于切割外植体等造成分布在液泡内的酚类物质与分布在各种质体内或细胞质内酶的这种区域性分布遭到破坏,从而使氧化酶和底物在氧气的作用下发生氧化反应,产生有毒的褐色醌类物质。酶、底物和氧化物是酶促褐化必须具备的3个条件,其中最主要的酶是多酚氧化酶(PPO),最主要的底物是酚类化合物。

酚类物质和酶的活性是影响褐化现象的主要原因,因此,降低褐化现象的主要途径是采取一系列有效抑制酚类物质合成和控制酶的活性的措施[8]。

1.1 引起褐化现象的因素

1.1.1外植体

1)植物种类和基因型。植物体内含有较高木质素、单宁、色素、黄酮等酚类化合物，容易发生褐变。木本植物比草本植物更易产生褐化[9]。

同种植物不同品种的外植体材料发生褐变的程度也不尽相同,如周俊辉等[10]通过对不同品种观赏凤梨的吸芽进行防褐研究,结果表明粉菠萝褐变程度最严重,然后是水塔花、红星凤梨,七彩凤梨褐变程度最轻。

2)外植体生理状态。取幼龄植物的幼嫩部位为外植体材料,其褐变程度远低于成龄植物的成熟部位。因为幼嫩材料中所含酚类化合物含量比成熟材料中的少,特别是木质素的含量,研究表明刚刚木质化或半木质化为最佳取材部位[11]。此外,冬春季取材会比夏秋季取材褐化程度低,如蝴蝶兰[12]组培夏季取材褐变较重。

1.1.2培养基

1)无机盐种类和浓度。培养基中无机盐的种类和浓度影响褐化,其一是因为培养基中一些无机物是合成某些氧化酶及其进行生理生化的必需元素[13],研究表明Ca2+、Mn2+、Mg2+等金属离子可能是PPO的激活剂;其二是因为高浓度的无机盐会造成外植体材料中的酚类物质溢出从而发生氧化反应,增加褐化率。如尚旭岚[14]、冯宁[15]等研究发现鹤望兰在1/2MS培养基的褐化率明显低于MS培养基。

2)培养基硬度。一部分学者认为,液体培养基比固体培养基更容易解决褐变问题,因为当外植体材料从切口处产生酚类物质的时候,在液体培养基中可以快速扩散从而减少对外植体材料的伤害。如鹤望兰在液体培养基中进行培养时褐变率较固体培养基低[14]。

3)培养基的pH值。培养基的pH值对愈伤组织褐变的抑制作用可通过改变植物体褐变过程中的酶活性完成。当培养基偏碱性时,PPO中的酶蛋白和Cu2+脱离析出,使PPO失去活性,从而减少褐变发生[6]。低 pH水培并不能抑制朱顶红鳞茎的褐化,且不利于朱顶红的生长与增殖[16]。

4)植物生长调节剂。培养基中激素种类、浓度和组合配比都会影响褐化。BA、ZT、KT等细胞分裂素会加速酚类化合物的产生,提高褐化率,而2,4-D、IAA等生长素会延缓酚类化合物的产生,降低褐化率[17]。但细胞分裂素和生长素在合适浓度的配比下不仅可以降低褐化率,还会促进外植体材料的生长分化,郝捷[18]在卡特兰愈伤组织继代培养中发现,培养基中添加3 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA增殖倍数和褐化率综合效果最好。

1.1.3抗褐化剂

抗褐化剂可以分为吸附剂、抗氧化剂和螯合剂三大类,三类抗褐化剂的种类和作用机理如表1所示。

表1 三类抗褐化剂Tab.1 Three kinds of antioxidants

不同草本观赏植物在组织培养过程中适合的抗褐化剂种类和防止褐化的效果存在很大差异,抗褐化剂的使用还会不同程度地影响外植体分化与生长,如廖焕琴[16]研究发现朱顶红鳞茎培养基中添加AC 表现出良好的抗褐化作用,且不影响增殖。

1.1.4其他影响因素

适当减少培养时间和增加转瓶时间会明显降低褐变程度,如陈菲等[19]通过对蝴蝶兰15 d,25 d,30 d继代转瓶培养的研究发现,随着转瓶周期的延长,外植体材料由正常生长到生长缓慢,色泽从绿色变成暗灰色,培养基也逐渐浑浊。培养温度过高或光照过强会增强PPO活性,从而加速褐变产生。因此,适当的低温处理或进行一段时间的暗培养有助于抑制外植体材料的褐化现象[12,20]。

1.2 防治褐化措施

1)选择半木质化或刚木质化的植物材料做外植体,如一年生植物茎段,茎尖等。

2)在植物休眠期或生长缓慢的季节进行取材,如早春或者冬季。

3)提前对外植体材料或者母苗进行低温处理、暗处理或热激处理。

4)选择适宜的培养基。

5)在不影响外植体材料正常生长的前提下,添加适宜种类和浓度的防褐剂。

6)低温处理或进行一段时间暗培养。

7)适当增加外植体转移的周期。

2 玻璃化

玻璃化是指在离体培养过程中,一些试管苗叶部甚至整个植株呈现出半透明甚至透明的水渍状,植株肿大失绿,叶片皱缩翻卷的现象,此类植株也被称为“玻璃苗”[21]。

2.1 玻璃化产生因素

研究发现,自然界中并不存在玻璃化现象,玻璃化只在组织培养的过程中发生[22]。有关玻璃化形成的原因,普遍认为是由于组培苗不适应培养环境,造成外植体体内水势、激素或以NH4+为主的矿质元素供应失衡而引起玻璃化发生[23]。

2.1.1外植体材料

外植体种类会影响玻璃化的发生。据统计,在目前已知的200多种出现过玻璃化的植物中[24],草本植物比木本植物更容易出现玻璃化现象。此外,外植体大小、生理年龄及取材部位也会影响玻璃化的发生,外植体材料生理年龄越小,体积越小,越容易产生玻璃化,通常幼叶>老叶、顶芽>茎中段>茎基部,这可能是由于木质化程度稍高的外植体材料里存在某种抗玻璃化物质[25]。

2.1.2培养基成分

1)琼脂和蔗糖浓度。固体培养基可以缓解玻璃化的产生,液体培养基容易造成玻璃化发生。一方面可能是由于琼脂中含有K+、Mg2+、Fe2+等物质,影响着外植体体内离子平衡;另一方面是琼脂和蔗糖维持着培养基的渗透压,决定着培养基的水势差。

2)NH4+。降低NH4+浓度会明显预防外植体材料玻璃化的产生,主要原因是高浓度NH4+会抑制木质素合成的酶,使植株木质化程度降低,从而产生玻璃苗。如黄花花[26]等在大花萱草‘黄绣客’的培养中发现,随着NH4NO3含量的减少,玻璃化率降低。

2.1.3培养环境

研究表明在植物离体培养期间,温度、光照、透气性等都间接影响外植体材料玻璃化。

1)光照。增加光照强度和光照时间有利于减少玻璃苗的发生,且越接近自然光的光照条件不仅可以明显降低玻璃化现象,还有利于外植体材料生长,甚至可以通过自然光照射恢复一些玻璃苗。可能是自然光中的紫外线有利于促进外植体材料木质化的形成[24]。

2)温度。研究发现24～26 ℃是组培最佳培养温度[27],当培养温度长时间超出或低于草本观赏植物正常生长的温度范围会引起植物体代谢发生紊乱,从而造成玻璃化。但也有研究表明适当的低温处理或在昼夜温差较大的环境中培养有利于缓解玻璃化现象[28]。

3)透气性。增加封口材料透气性主要是为了使培养器皿中的O2、CO2、乙烯达到动态平衡、降低培养环境的相对湿度从而减少玻璃化现象。“塑料瓶+棉塞”[27]是增加透气性的最佳搭配。

2.2 玻璃化防治措施

玻璃化现象的发生是适应性的生理问题,具有逆向生长的特点[23]。近些年来对于玻璃化的防控措施主要是前期预防与后期恢复相结合,具体可以采取以下措施:

1)采用NH4+的浓度较低的培养基,如B5、NH4+较低的MS 等基本培养基。

2)适当降低细胞分裂素6-BA的用量,增加干物质的积累。

3)降低培养基中的水势,如采用固体培养基,控制蔗糖浓度。

4)改善培养基的通气状况,采用透气性好的材料做培养容器[29]。

5)在培养基中添加抗玻璃化的物质,如AgNO3、青霉素、多效唑等。

6)增加自然光照射时间,最好是在自然光下进行培养。

7)热激处理。

3 菌类污染

污染是指在植物离体培养期间,外植体材料在适宜的环境中受到细菌、真菌等微生物的侵染,导致培养基被污染,外植体死亡的一种现象[30]。

3.1 植物组织培养中污染来源

植物组织培养中的污染按病原可分为细菌污染和真菌污染两大类,其特点如表2所示。

表2 细菌污染和真菌污染Tab.2 Bacterial contamination and fungal contamination

3.2 污染防治

由于细菌通过分裂进行繁殖,所以当培养基受到细菌污染的时候,可以通过采取切除感染部分来挽救外植体材料;而真菌是靠孢子繁殖,传播性比较快,所以一旦外植体材料受到真菌污染,需对污染的种苗进行高温高压灭菌处理,以防对环境造成污染。通常可以采取以下措施来预防污染发生。

3.2.1外植体材料

成年植株生长环境越复杂,带菌越多,可以将一些易被污染的植物种植在温室或进行水培,采取较幼嫩的部分作为外植体材料;其次最好是在晴朗的中午进行取材,强烈的阳光可以杀死部分真菌和细菌。如王安石等[34]在文心兰组织培养中发现晴天上午11:00采摘外植体成活率高,在高温多雨季节采摘外植体极易受到污染。另外不同外植体材料所选用的灭菌工序、灭菌试剂和灭菌时间存在差异,具体植物需要具体分析。

3.2.2无菌防控

建立无菌环境的接种室和培养室,定期用75%(体积分数)酒精喷雾或2%(体积分数)的新洁尔灭溶液等对操作室、培养室等进行消毒,也可以用紫外线灯照射或甲醛熏蒸消毒,要求操作人员在操作过程达到无菌操作,如在接种时双手切勿触碰外植体材料;进入超净工作台前用酒精擦拭双手;操作人员的着装进行灭菌处理,如戴口罩、无菌帽,穿无菌服等。

3.2.3添加抑菌剂

在培养基中添加抗生素可以有效防止污染的发生,如在铁皮石斛的组织培养中添加链霉素[35],在竹芋组织培养中添加庆大霉素[36]能够有效抑制细菌的产生。抗生素的使用促进了组培技术的新发展,开放式组织培养不仅放宽了对培养环境的要求,还有效减少污染发生[37]。然而抗生素是一种极其不稳定的物质,遇高温易分解[32],所以在组培过程中不可直接与培养基进行高温灭菌,需进行过滤灭菌,加大了工作流程,增加了生产成本。此外,长期使用抗生素不但无法减轻污染,还会对植物产生毒害作用[37]。

3.2.4新型消毒方法

经过科学家不断大胆探索,得到一些新型消毒剂和消毒方法来进一步减少污染的产生。如真空减压方法灭菌、臭氧消毒、磁力搅拌、超声振动、多次灭菌、多种灭菌剂混合灭菌等方法[38]。

4 结语

纵观影响褐变和玻璃化的因素,可以明显看出褐变和玻璃化的影响因素大同小异,但对褐变和玻璃化影响程度却大相径庭,如木质化程度越高的外植体材料越容易发生褐变却不易发生玻璃化;固体培养基比液体培养基更有利于减轻玻璃化的发生,对褐变的影响却不相同。这可能是由于褐变和玻璃化发生机理不同,引起外植体材料体内相关基因、酶、蛋白质等发生相互作用。

采取增加自然光照射、进行热激处理和加大昼夜温差等措施可以使玻璃苗恢复成正常苗,今后可以加大对恢复玻璃苗的研究,减少玻璃苗的浪费。

相对于褐变和玻璃化,菌类污染主要是由于外界环境和人员操作不当造成的,然而,一旦外植体材料发生污染现象,外植体材料死亡几率最大,且遭受真菌污染的外植体材料将无法再次使用。通过对操作环境进行不断消毒灭菌、提高操作人员组培技术来尽可能减少污染,将污染控制在低水平。除此之外,可以通过添加抑菌剂或改进消毒灭菌的方法来减少污染发生,但目前所使用的抑菌剂大都成本较高,长期使用还可能对外植体产生毒害作用,所以寻找更加高效无毒的方法来代替抑菌剂是非常值得探索的问题。

目前有关对褐化、玻璃化及菌类污染发生机理研究还处在浅层次的分析阶段,相信未来对造成褐化、玻璃化及菌类污染相关基因、蛋白、酶及其他分子领域的不断深入研究,会从根源上解决三大难题。