miR-147a靶向ATF2抑制非小细胞肺癌细胞侵袭和迁移①

王艾青 郑秀花 刘瑾春 陈玉芳 鲍启德 田振涛 （河南护理职业学院临床医学系，安阳 455000）

肺癌是世界范围内癌症相关死亡的主要原因，每年有近220万例新发病例和150万例死亡病例［1］。其中非小细胞肺癌占80%，可细分为鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌［2］。尽管外科手术和化学疗法方面取得了长足进步，但非小细胞肺癌的频繁复发和转移仍是急需解决的问题。微小RNA（miRNA）是一类小的非编码RNA，具有转录后调节靶基因表达的能力，研究表明大量miRNA 在肿瘤转移中起重要作用。miR-147a 位于染色体9q33.2 区域，在膀胱癌、宫颈癌等肿瘤细胞中低表达，具有抑癌作用［3-4］。已有研究表明血清miR-147低表达与非小细胞肺癌预后不良显著相关［5］。LI 等［6］研究表明 miR-147 通过抑制BDNF 表达抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭。激活转录因子2（activate transcription factor 2，ATF2）属于环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）响应元件结合家族，与非小细胞肺癌侵袭和迁移密切相关［7］。本文主要探究miR-147a靶向ATF2 对非小细胞肺癌迁移、侵袭和上皮-间质转化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织 收集 2018 年 4 月至 2020 年 4 月濮阳市安阳地区医院收治的40例非小细胞肺癌患者，手术切除非小细胞肺癌组织及癌旁组织，-80 ℃保存。本研究经濮阳市安阳地区医院伦理委员会批准，并根据《赫尔辛基宣言》道德准则进行，所有患者知情同意。

1.1.2 实验动物 20 只4 周龄SPF 级雌性裸鼠（BALB/c）购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体质量13~15 g，许可证号：SCXK（京）2016-0011。饲养于SPF 级25 ℃、50%~60%相对湿度环境，12 h/d光照，自由饮食饮水，适应性喂养1周后进行实验。

1.1.3 细胞与主要试剂 正常肺上皮细胞BEAS-2B和非小细胞肺癌细胞系H1703、A549、H1299、L78、PGCL3 均购自上海素冉生物科技有限公司；miRNC、pc-NC、miR-147a mimic、pc-ATF2 质粒和实验所用引物由北京奥科生物科技有限公司设计合成；胎牛血清（QS071，北京百奥莱博科技有限公司）；Lipofectamine2000 转染试剂（11668030，美国 Thermo fisher）；DMEM 培养基（D5546，上海辅泽商贸有限公司）；青霉素和链霉素双抗溶液（C0160-611，北京沃比森科技有限公司）；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（T002，北京威格斯生物技术有限公司）；RIPA裂解缓冲液（PC101，上海雅酶生物科技有限公司）；SYBR-Green PCR试剂盒（RT0411-03，嘉兴蓝诺盛生物科技有限公司）；BCA 试剂盒（WB027，西安浩特生物科技有限公司）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、ATF2兔源 单 克 隆 抗 体（ab36151、ab231303、ab76011、ab92547、ab239361，上海艾博抗生物科技有限公司）；Transwell 小室（254480，北京明阳科华生物科技有限公司）。

1.1.4 仪器 FluorChem HD2 凝胶成像系统（美国Proteinsimple 公司）；BS-1101 全自动多功能酶标仪（北京华泰和合商贸有限公司）；FACS Calibur 流式细胞仪（美国BD 公司）；Seahorse XF24 分析仪（美国Seahorse 公司）；Thermo Fisherbrand 数码生物显微镜（上海睿安生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 所有细胞于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和链霉素双抗溶液的DMEM培养基中37 ℃、5%CO2培养。

1.2.2 RT-qPCR 检测miR-147a 表达 将正常肺组织和非小细胞肺癌组织剪碎并研磨，裂解提取总RNA。将正常肺上皮细胞BEAS-2B 和非小细胞肺癌细胞系 H1703、A549、H1299、L78、PGCL3 接种于12 孔板，85%融合时采用RIPA 裂解提取总RNA，逆转录为cDNA 逆转录，以cDNA 为模板按SYBRGreen PCR 试剂盒说明书进行RT-qPCR。miR-147a循环条件：98 ℃ 10 s、55 ℃ 10 s、72 ℃ 90 s，40 个循环，以 U6 为内参。ATF2 循环条件：95 ℃ 5 s、60 ℃10 s、72 ℃ 30 s，45 个循环，以 GAPDH 为内参，2-ΔΔCt法计算，实验重复3次，引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.3 细胞转染 取对数期非小细胞肺癌细胞H1703，1×106个/孔接种于 12 孔板，85% 融合时，根据 Lipofectamine2000 说明书将 miR-NC、pc-NC、miR-147a mimic、pc-ATF2 质粒分别或联合转染至H1703细胞。

1.2.4 双荧光素酶报告检测靶向关系 收集对数生长期 H1703 细胞接种于 24 孔板，37 ℃、5%CO2培养24 h。将1 μg PGL3-ATF2-WT（ATF2 野生型）或PGL3-ATF2-MUT（ATF2 突变型）及miR-NC 或 miR-147a mimic 和 PRL-CMV 质粒共转染至 H1703 细胞，转染48 h 后裂解15 min，双荧光素酶检测系统测量荧光素酶相对活性，荧光素酶相对活性（R/F）=萤火虫荧光素酶活性/肾荧光素酶活性。

1.2.5 Transwell 检测细胞侵袭 在基底胶包埋的Transwell 小室上室接种按1.2.3 转染的非小细胞肺癌细胞H1703 悬浮液和不含血清的培养基，终浓度为 2.5×105个/ml，Transwell 小室下室加入含血清培养基培养24 h，取出Transwell小室，5%结晶紫染色，显微镜下观察。

1.2.6 划痕实验检测细胞迁移 将1.2.3 转染的非小细胞肺癌细胞 H1703 以 1×106个/孔接种于12 孔板，铺满单层后用小号枪头在孔中间垂直划痕，37 ℃、5%CO2培养24 h，在划痕0 h和24 h拍摄图像，Image J 评估细胞迁移能力，计算划痕闭合率（%）=（初始宽度-测量宽度）/初始宽度×100%。

1.2.7 Western blot 检 测 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 和ATF2蛋白表达 采用RIPA 裂解液提取正常肺组织和非小细胞肺癌组织、正常肺上皮细胞BEAS-2B 和不同非小细胞肺癌细胞系及1.2.3 转染的非小细胞肺癌细胞H1703 总蛋白，BCA 试剂盒定量，SDS-PAGE 分离等量（40 μg）总蛋白，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉/TBST 封闭2 h。加入一抗（E-cadherin 1∶1 000、N-cadherin 1∶1 000、Vimentin 1∶800、ATF2 1∶1 500）4 ℃孵育过夜，TBST 清洗 3 次，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（1∶2 000）室温孵育 1 h，TBST 清洗 3 次，ECL 发光液显影，Image-Pro plus 6.0分析蛋白条带灰度，按下式计算蛋白相对表达，蛋白表达量=目标蛋白积分吸光度/内参蛋白GAPDH积分吸光度。

1.2.8 裸鼠移植瘤实验 所有裸鼠分为4 组：control 组、miR-147a mimic 组、pc-ATF2、miR-147a+pc-ATF2 组，每组5 只，每只裸鼠左腋下皮下注射100 ml转染后的非小细胞肺癌细胞H1703（5×106个，PBS 溶解），SPF 级环境饲养，正常饮食。第 30 天颈椎脱位法处死裸鼠，完整取出皮下肿瘤，免疫组化检测 N-cadherin 阳性表达，Western blot 检测 E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达。

1.2.9 免疫组化检测N-cadherin 阳性表达 石蜡切片经脱蜡水化，过氧化物酶阻断内源性过氧化物酶活性，加入兔源 N-cadherin 单克隆抗体（1∶500）4 ℃孵育过夜，滴加生物素标记二抗，DAB 显色，蒸馏水冲洗，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片观察统计，棕黄色为细胞阳性，随机选取5 个视野，Image J 计数阳性细胞，计算阳性细胞百分比（%）。

1.3 统计学分析 采用GraphPad Prism 5.0 软件进行统计分析，所有数据以表示。两组间比较采用Student'st检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-147a 在非小细胞肺癌中表达下调，而ATF2表达上调 与正常肺组织相比，非小细胞肺癌组织 miR-147a 表达显著下调（P＜0.01，图 1A），ATF2 mRNA和蛋白表达显著上调（P＜0.01，图1B、C）；与正常肺上皮细胞BEAS-2B 相比，非小细胞肺癌细胞系 H1703、A549、H1299、L78、PGCL3 中 miR-147a表达显著下调，ATF2 蛋白表达显著上调（P＜0.01，图1D、E），H1703 变化最为显著，因此选取H1703 细胞进行后续实验。

图1 非小细胞肺癌中miR-147a和ATF2表达Fig.1 Expressions of miR-147a and ATF2 in non-smallcell lung cancer cells

2.2 miR-147a 靶向下调 ATF2 表达 Targetscan 软件预测发现，miR-147a 与ATF2 存在靶向关系，3'UTR 区存在结合位点（图2A）；双荧光素酶实验结果显示，miR-147a与ATF2-WT共转染显著降低荧光素酶活性（P＜0.01，图2B）。与对照组相比，mimic-NC 组miR-147a 表达差异无统计学意义，miR-147a mimic组miR-147a 表达显著上调（P＜0.01，图2C），表明转染成功。与对照组相比，miR-NC 和pc-NC 组H1703细胞ATF2 表达差异无统计学意义，miR-147a mimic组 H1703 细 胞 ATF2 表 达 显 著 下 调 ，pc-ATF2 组H1703细胞ATF2表达显著上调（P＜0.01，图2D）；与miR-147a mimic 组相比，miR-147a mimic+pc-ATF2组 H1703 细 胞 ATF2 表 达 显 著 上 调（P＜0.01，图2D）。

图2 miR-147a与ATF2的靶向关系Fig.2 Targeting relationship between miR-147a and ATF2

2.3 miR-147a 靶向 ATF2 抑制 H1703 细胞侵 袭与对照组相比，miR-NC 和 pc-NC 组 H1703 细胞侵袭数无明显变化，miR-147a mimic 组H1703 细胞侵袭数显著减少，pc-ATF2 组H1703 细胞侵袭数显著增多（P＜0.01，图3）；与miR-147a mimic 组相比，miR-147a mimic+pc-ATF2组H1703细胞侵袭数显著增多（P＜0.01，图3）。

图3 Transwell 检测miR-147a 对H1703 细胞侵袭能力的影响（×200）Fig.3 Effect of miR-147a on invasion ability of H1703 cells detected by Transwell（×200）

2.4 miR-147a 靶向 ATF2 抑制 H1703 细胞迁 移与对照组相比，miR-NC 和pc-NC 组划痕闭合率无明显变化，miR-147a mimic 组划痕闭合率显著降低，pc-ATF2 组划痕闭合率显著升高（P＜0.01，图4）；与miR-147a mimic 组相比，miR-147a mimic+pc-ATF2组划痕闭合率显著升高（P＜0.01，图4）。

图4 划痕实验检测miR-147a 对H1703 细胞迁移能力的影响（×100）Fig.4 Effect of miR-147a on migration ability of H1703 cells tested by scratch experiment（×100）

2.5 miR-147a 靶向 ATF2 抑制 H1703 细胞上皮-间质转化 与对照组相比，miR-NC 和pc-NC 组H1703细胞 E-cadherin、N-cadherin 和 Vimentin 表达差异无统计学意义，miR-147a mimic 组H1703 细胞E-cadherin 表达显著上调，N-cadherin 和 Vimentin 表达显著下调，pc-ATF2 组 H1703 细胞 E-cadherin 表达显著下调，N-cadherin 和 Vimentin 表达显著上调（P＜0.01，图 5）；与 miR-147a mimic 组相比，miR-147a mimic+pc-ATF2 组 H1703 细胞 E-cadherin 表达显著下调，N-cadherin 和 Vimentin 表达显著上调（P＜0.01，图5）。

图5 Western blot 检测 miR-147a 对 H1703 细胞上皮-间质转化相关蛋白表达的影响Fig.5 Effect of miR-147a on expressions of epithelialmesenchymal transition-related proteins in H1703 cells detected by Western blot

2.6 miR-147a 靶向 ATF2 抑制 H1703 移植瘤 与对照组相比，miR-147a mimic 组移植瘤中N-cadherin阳性细胞百分比降低，E-cadherin 表达显著上调，N-cadherin 和 Vimentin 表达显著下调，pc-ATF2 组移植瘤中N-cadherin 阳性细胞百分比升高，E-cadherin表达显著下调，N-cadherin 和Vimentin 表达显著上调（P＜0.01，图6）；与miR-147a mimic 组相比，miR-147a mimic+pc-ATF2 组移植瘤中N-cadherin 阳性细胞百分比升高，E-cadherin 表达显著下调，N-cadherin和Vimentin表达显著上调（P＜0.01，图6）。

图6 miR-147a 对裸鼠移植瘤中上皮-间质转化相关蛋白的影响（×200）Fig.6 Effect of miR-147a on epithelial-mesenchymal transition related proteins in transplanted tumors in nude mice（×200）

3 讨论

非小细胞肺癌是癌症相关死亡的最重要原因，而癌症转移导致90%以上癌症相关死亡［8］。肿瘤细胞侵袭和迁移能力反映肿瘤的转移能力，因此，寻找能够抑制非小细胞肺癌侵袭和迁移的新型分子或治疗靶标至关重要。

近年研究已证明miRNA 在包括非小细胞肺癌在内的各种肿瘤发生和转移中起关键作用。miR-147在多种肿瘤中发挥抑癌作用，如过表达miR-147通过抑制结肠癌上皮-间质转化而抑制干细胞样特征［9］；miR-147通过AKT/mTOR 信号通路抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移［10］；miR-147通过抑制HOXC6抑制人肝癌细胞增殖、迁移和化疗敏感性［11］。且已有研究表明，miR-147靶向BDNF抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭［6］。本研究表明，与miR-147高度同源的miR-147a 在非小细胞肺癌组织和细胞中低表达，且发现miR-147a 抑制H1703 细胞迁移、侵袭和上皮-间质转化。

miRNA 可通过与靶mRNA 3'UTR 结合而诱导mRNA 降解或抑制基因表达。越来越多证据表明，ATF2是多种miRNA的靶标，如miR-26b、miR-204和miR-622等［12-13］。本研究结果证实ATF2是miR-147a的靶标，且在H1703细胞中受miR-147a调节。ATF2参与多种调控生物学进展，包括基因转录、DNA 损伤、代谢和肿瘤发生。如ATF2 在肾细胞癌中可预测不良预后和促进恶性表型［14］；ATF2常组蛋白去甲基化酶JMJD1C 下调通过靶向ATF2 抑制结直肠癌转移［15］；miR-181a和miR-203通过与ATF2相互作用抑制喉癌细胞迁移和侵袭［16］；miR-622 通过直接靶向 ATF2 抑制胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移［12］。本研究表明，miR-147a 过表达减少H1703 细胞侵袭数，降低划痕闭合率，共转染pc-ATF2 可逆转该作用，与既往研究结论一致，说明miR-147a 靶向pc-ATF2 可抑制H1703 细胞侵袭和迁移，从而抑制H1703细胞转移。

转移发展过程中，调节细胞与细胞间黏附及细胞与细胞外基质黏附对癌细胞迁移和侵袭至关重要［17］。迁移和进展的初始步骤基本取决于上皮-间质转化，其特征为特定形态发生变化。上皮-间质转化由一系列复杂事件组成，其标志为上皮细胞与细胞和细胞基底膜附着丧失及间充质样形态获得，伴随基因表达改变，包括上皮标志物表达（如E-cadherin）减少和间充质标志物（如N-cadherin 和Vimentin）表达增加［18］。本研究发现，miR-147a 过表达上调 H1703 细胞 E-cadherin 表达 ，下调 N-cadherin 和Vimentin 表达，共转染pc-ATF2 可逆转该作用，说明miR-147a 靶向 pc-ATF2 抑制 H1703 细胞上皮-间质转化，从而抑制H1703 细胞转移。E-cadherin 是钙依赖性跨膜黏附蛋白家族成员之一，主要介导同型细胞间黏附作用。如E-cadherin 表达下降，肿瘤细胞连接松散，也可使肿瘤细胞分裂增殖失控，导致肿瘤细胞从原发灶脱落而发生局部或远处转移［19］。肿瘤形成过程，N-cadherin 表达有利于肿瘤血管形成，使肿瘤易于生长和转移［20］。Vimentin 是一种在间质表达的Ⅲ型中间丝状体蛋白，在上皮细胞迁移及肿瘤侵袭中具有重要作用，与肿瘤浸润转移密切相关［21］。

综上所述，miR-147a 靶向 ATF2 抑制 H1703 细胞迁移、侵袭和上皮-间质转化。说明miR-147a 和ATF2可成为治疗和预防非小细胞肺癌的潜在靶点。本文仅对非小细胞肺癌侵袭、迁移和上皮-间质转化进行了初步探讨，分子机制有待进一步研究。