时差成像技术辅助胚胎选择在单胚胎移植中的应用价值

田可可，王娟，闫虹，杜威，吕玉珍

(焦作市妇幼保健院 生殖医学科，河南 焦作 454000)

在辅助生殖技术中，为了保证较高的临床妊娠率，传统移植策略通常是移植2～3枚胚胎，这就导致多胎妊娠率显著增高。有研究表明，双胚胎移植是多胎妊娠最主要的影响因素[1]。为了减少多胎妊娠所带来的母婴并发症，选择性单胚胎移植逐渐成为未来生殖医学发展的方向。然而，如何选择发育潜能最好的胚胎用于移植，从而在降低多胎率的同时保证临床妊娠率，仍是生殖医学领域研究的难题。几十年来，传统的胚胎形态学评分(conventional morphological assessment，CMA)方法由于其简单实用、无创、低成本等特点，在世界各个生殖中心被广泛采用。然而，胚胎发育是一个连续性的动态过程，传统的胚胎评估方法是在特定的时间点将胚胎移出培养箱进行观察，由于不能进行连续的观察，收集到与胚胎发育相关的指标非常有限。近年来兴起的时差成像技术(time-lapse monitoring technology，TLT)较好地克服了这一弊端，可以对胚胎的发育过程进行连续的监测，捕捉胚胎发育各个阶段的图像并合成动态视频，为胚胎选择提供更多的参考信息[2]。对于TLT能否改善妊娠结局，学者们持不同的观点。Pribenszky等[3]及纪冰等[4]研究表明，通过TLT提供的动力学参数筛选胚胎，可显著改善体外受精的妊娠结局。另有研究报道，采用TLT筛选胚胎与传统的静态形态学评估相比并无优势[5]。目前国内关于选择性单胚胎移植中应用TLT的文献报道较少，本研究比较了应用TLT辅助胚胎选择在卵裂期单胚胎移植及单囊胚移植中的临床妊娠结局，从而探讨TLT的临床应用价值，旨在为临床工作中TLT在选择性单胚胎移植中的应用提供参考。

1 资料和方法

1.1 研究对象对2019年1月至2021年6月在焦作市妇幼保健院生殖医学科治疗的体外受精/卵胞浆内单精子注射-胚胎移植(in-vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection-embyro transfer，IVF/ICSI-ET)周期患者的资料进行回顾性分析。(1)纳入标准：①女方年龄<40岁；②月经第3天血清卵泡刺激素<12 IU·L-1；③获卵数≥6枚，取卵后第3天形成的优质胚胎≥4枚，患者于取卵后第3天或第5天行单胚胎移植，所移植的卵裂期胚胎及囊胚均为优质胚胎。(2)排除标准：①女方存在反复移植失败、反复流产等不良预后情况；②子宫肌瘤、子宫腺肌症、子宫内膜异位症；③子宫畸形，如单角子宫、纵隔子宫、双子宫等；④补救卵胞浆内单精子注射(rescue intracytoplasmic sperm injection，R-ICSI)。共纳入414例患者，依据胚胎筛选方法和胚胎发育时期分为4组：传统形态学评分-卵裂期单胚胎移植组(CMA-single cleavage embryo transfer，CMA-SCT，n=130)、时差成像-卵裂期单胚胎移植组(TLT-single cleavage embryo transfer，TLT-SCT，n=90)、传统形态学评分-单囊胚移植组(CMA-single blastocyst transfer，CMA-SBT，n=105)、时差成像-单囊胚移植组(TLT-single blastocyst transfer，TLT-SBT，n=89)。

1.2 治疗方法采用卵泡期长方案，于月经第2天抽血和B超检查后，肌内注射长效亮丙瑞林(上海丽珠制药有限公司，国药准字H20093852)3.75 mg，30 d后复诊，至调节达标[6](子宫内膜厚度≤5 mm，血清卵泡刺激素<5 IU·L-1，血清黄体生成素<5 IU·L-1，双侧卵巢内卵泡直径<5 mm，雌二醇<50 ng·L-1)后使用促卵泡生长激素，具体用量根据卵巢储备、年龄及体质量等进行调整。当16 mm以上的卵泡占主导卵泡60%左右时，注射8 000～10 000 IU人绒毛膜促性腺激素(上海丽珠制药有限公司，国药准字H44020672)，36～37 h后在超声引导下经阴道穿刺取卵。

1.3 胚胎体外培养

1.3.1捡卵与授精 经阴道穿刺获得的卵冠丘复合物经ART-1023(美国SAGE)洗涤后转入序贯培养液ART-1020中，置于COOK培养箱中培养。行常规体外受精的卵子，在获卵3 h后采用微滴法进行受精。调整精子浓度为1.0×106个·mL-1，制备成微滴皿，每个微滴含受精培养液50 μL，每个微滴中加入1个卵子，受精后4～6 h拆除颗粒细胞。行卵胞浆单精子注射的卵子在获卵后3 h拆除颗粒细胞，获卵后4～5 h行显微注射。

1.3.2胚胎培养

1.3.2.1Time-lapse培养箱 卵子在IVF授精后4～6 h去除颗粒细胞或常规ICSI后，放入预先在37 ℃、体积分数为6%的CO2培养箱中平衡过夜的ESCO培养皿的ART-1026培养液微滴中，置入ESCO时差成像培养箱中培养，培养箱环境为37 ℃、CO2体积分数为6%、O2体积分数为5%。受精后第3天，除移植和冷冻的胚胎外，剩余胚胎一对一的移入预先在37 ℃、体积分数为6%的CO2培养箱中平衡过夜的ART-1029培养液微滴中，置入ESCO培养箱行囊胚培养。设置拍摄间隔时间为5 min。

1.3.2.2传统培养箱 卵子在IVF授精后4～6 h去除颗粒细胞或常规ICSI后，放入预先在37 ℃、体积分数为6%的CO2培养箱中平衡过夜的FALON培养皿的ART-1026培养液微滴中，置入COOK培养箱中培养，培养箱环境为37 ℃、CO2体积分数为6%、O2体积分数为5%。受精后第3天，除移植和冷冻的胚胎外，剩余胚胎转移入预先在37 ℃、体积分数为6%的CO2培养箱中平衡过夜的ART-1029培养液微滴中，置入COOK培养箱行囊胚培养。

1.4 胚胎评分标准及胚胎选择4组研究对象均于受精后16～18 h进行原核评估，受精后第3天卵裂期胚胎依据Istanbul共识[7]进行评分，细胞数为7～9个，碎片程度小于10%的胚胎视为优质胚胎，受精后5～6 d参考Gardner评分标准[8]进行囊胚评分，评分为3期及3期以上且内细胞团及滋养层评分不含C的囊胚视为优质囊胚。TLT-SCT组及TLT-SBT组以IVF及ICSI受精时间为起点，人工标注胚胎发育的动力学参数，发育至2细胞时间为t2，发育至3细胞时间为t3，以此类推为t4、t5、t6、t7和t8，并记录异常卵裂事件。本研究TLT挑选胚胎首先排除非二倍性卵裂、逆卵裂、非对称卵裂、发育阻滞等异常卵裂模式，其次基于动力学参数cc2≤11.5 h(cc2为t3与t2之差，即2细胞发育至3细胞所需时间)，s2≤0.75 h(s2为t4与t3之差，即3细胞发育至4细胞所需时间)。

1.5 妊娠随访行卵裂期单胚胎移植者，于取卵后第3天移植1枚最优质胚胎；行单囊胚移植者，于取卵后第5天移植1枚最优质囊胚，移植后常规行黄体支持。移植后14 d检测血绒毛膜促性腺激素(β-human chorionic gonadotropin，β-hCG)，如β-hCG≥50 IU·L-1，4～6周B超检查见孕囊及原始心管搏动视为临床妊娠。临床妊娠率为临床妊娠周期数占移植周期数的百分数，早期流产率为孕早期流产周期数占临床妊娠周期数的百分数。

2 结果

2.1 一般资料4组患者的年龄、不孕年限、体质量指数、基础卵泡刺激素、抗苗勒氏管激素、窦卵泡计数、雌二醇峰值、内膜厚度、获卵数比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 4组患者一般资料比较

2.2 各组受精方式占比及胚胎发育指标4组患者的受精方式占比、正常受精率、卵裂率及优质胚胎率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组受精方式占比及胚胎发育指标比较

2.3 各组妊娠结局所有患者均移植1枚胚胎，妊娠随访中，4组患者均无多胎的发生，临床妊娠率与种植率相同。4组间临床妊娠率比较，差异有统计学意义(P<0.001)，4组间早期流产率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。TLT-SCT组的临床妊娠率高于CMA-SCT组(P<0.05)。TLT-SBT组的临床妊娠率与CMA-SBT组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。TLT-SCT组的临床妊娠率低于CMA-SBT组及TLT-SBT组(P<0.05)。见表3。

表3 不同胚胎筛选方法的临床结局比较[n(%)]

3 讨论

胚胎选择在单胚胎移植中至关重要，多年来，多数生殖中心仍是基于传统的胚胎评估方法评价胚胎活力，即在特定的时间点对胚胎进行观察，依据胚胎形态学指标如原核数、卵裂球数目、卵裂球大小及均一性、胚胎碎片、胞质空泡等进行评分。然而，胚胎发育是一个连续性的动态过程，仅从特定时间点对胚胎进行观察并不能全面了解胚胎的发育情况。TLT的出现为实时观察胚胎的发育提供了可能。TLT与培养箱的整合产生了新型的胚胎培养与监测系统，即时差成像培养箱。它与传统培养箱相比，在观察胚胎时无需将胚胎取出，能更大程度地保证胚胎培养微环境的稳定。已有文献报道，时差成像培养系统对IVF的妊娠围产结局无不良影响，是进行胚胎培养安全有效的方法[4]。更为重要的是，TLT能够获得更多的胚胎发育相关信息，如双极体出现的时间、原核出现及消失时间、细胞分裂时间、囊胚腔出现、囊胚扩张及孵化时间，并可记录卵裂模式，为胚胎评估提供了更多可参考的指标[2]。然而，通过TLT评估和筛选单胚胎进行移植能否改善临床妊娠结局，目前尚无定论。

本研究比较了2种胚胎评估及筛选方法在卵裂期单胚胎移植及单囊胚移植中的妊娠结局，结果显示，在卵裂期单胚胎移植中，采用TLT筛选胚胎与传统形态学评分相比，能提高妊娠率。而在单囊胚移植中，2种方法妊娠结局无差异。此外，应用TLT筛选胚胎行卵裂期单胚胎移植的妊娠结局虽优于传统形态学评分，但其妊娠率及种植率仍低于单囊胚移植。

本研究所基于的动力学参数s2和cc2已被多中心报道能够很好地预测胚胎发育潜能[9-10]，且有研究表明，非二倍性卵裂、逆卵裂、非对称卵裂、发育阻滞等异常卵裂模式会影响胚胎的发育潜能，导致囊胚形成率降低[11]。本研究TLT组筛选胚胎排除了可能影响胚胎发育潜能的异常卵裂，并结合能够预示早期胚胎发育能力的时间参数，这可能是TLT组卵裂期单胚胎移植妊娠率提高的原因。此外，本研究结果显示，单囊胚移植中两组妊娠结局差异无统计学意义，这与Revelli等[12]研究结果一致，即当胚胎延长培养至第5天时，TLT在胚胎筛选方面的优势消失。

有文献报道，早期胚胎在体外培养过程中存在阻滞现象[13]。而囊胚培养通过延长体外培养时间，可对胚胎起到一定的筛选作用，淘汰有缺陷的胚胎，从而筛选出发育潜力更好的胚胎[14]。并且胚胎经体外进一步培养至囊胚期行移植，与子宫内膜的同步性更好[15]。国内有研究通过meta分析发现，囊胚期胚胎移植与卵裂期胚胎移植相比，可获得更高的临床妊娠率[16]，这可能解释了本研究结果中，无论是采用传统形态学评分挑选胚胎还是TLT辅助胚胎选择，卵裂期单胚胎移植的临床妊娠率均低于单囊胚移植。

然而，囊胚移植虽有诸多优势，目前仍存在一些问题。例如，囊胚培养可能对出生婴儿的性别比产生影响，有研究显示囊胚移植的男婴率高于卵裂期[17-18]，此外，目前多数生殖中心采用的冷冻策略通常是在第3天冷冻1～2枚评分较高的胚胎，剩余胚胎继续养囊胚，这就可能导致部分患者行囊胚培养后无可利用囊胚形成，从而使周期取消率增高。

综合利弊，在临床诊疗过程中，医生需结合患者的胚胎发育情况选择合适的移植方案，单囊胚移植为降低多胎率并保证妊娠率的首选方案，行单囊胚移植时，无需使用TLT即能获得良好的妊娠结局，但对于第5天囊胚形成可能性较小的患者，应用TLT行卵裂期单胚胎移植，不失为一种改善妊娠结局的有效办法。本研究所得到的结果对临床移植方案的选择有一定的参考意义，但本研究属于单个中心的回顾性研究，一些可能影响妊娠结局的相关因素未纳入研究，可能导致研究结果存在一定的偏倚，故仍需前瞻性随机对照研究进行验证。