UPLC-QTOF-MS法直接检测碳酸饮料和茶饮料中8 种甜味剂

杨志敏，陈 源，刘淑坡，李 飞，李四中

（1.华侨大学a.分析测试中心；b.土木工程学院；c.材料科学与工程学院，福建厦门 361021；2.谱优科技（福州）有限公司，福州 350009）

0 引言

甜味剂作为一种无能量的蔗糖替代品，它的甜度可能是蔗糖的1.3 万倍，广泛应用于食品和饮料当中［1］。据估计，全球28%的人每天都食用甜味剂［2］。传统的甜味剂有甜蜜素、糖精钠、安赛蜜、阿斯巴甜和三氯蔗糖等，近年来又出现纽甜、甜菊糖苷等新型甜味剂。随着甜味剂种类不断增加以及应用领域的逐渐拓宽，其存在的问题也日益彰显［3］。一些研究表明，大量食用甜味剂可能会对人类产生不良影响，如代谢紊乱、肾功能紊乱，甚至引发癌症等疾病［4］。又因为甜味剂大多以复配形式添加，因此，建立一种同时检测食品中多种甜味剂的方法至关重要。

甜味剂的检测方法较多，主要有气相色谱法［5-6］、高效液相色谱法［7-8］、液相色谱串联质谱法［9-11］。这些传统方法往往不能很好地分离多种甜味剂，而且检出限较高，前处理过程复杂，容易受基质干扰出现假阳性的结果［12］。超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱仪（UPLC-QTOF-MS）结合了超高效液相的高分离能力和四极杆飞行时间质谱的高分辨功能，它不仅可以提供母离子精确分子质量，还可以提供大量多级碎片离子及其精确分子质量信息［13］，凭借其高通量、高分辨率、谱库检索、不依靠标准品也可分析等能力［14］，成为食品安全、药物分析等领域重要分析手段。

本研究选取安赛蜜、甜蜜素、糖精钠、阿斯巴甜、阿力甜、纽甜、三氯蔗糖和甜菊糖苷8 种甜味剂作为研究对象，采取直接过滤进样的方式，建立了基于UPLCQTOF-MS检测市售10 种碳酸饮料和茶饮料中8 种甜味剂的分析方法，并以实际样品为代表，对这一新方法进行了考察，还就UPLC-QTOF-MS 不依靠标准品就能定性的特点对其他10 种文献中报道过的甜味剂进行定性分析，为食品安全监测提供了新方法和技术支持。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1290 Infinity II 超高效液相色谱仪（美国Agilent公司产品），二元泵（G7120A）、自动进样装置（G7167B）、柱温箱（G7116B）；Agilent 6545 飞行时间质谱仪（美国Agilent 公司产品），配有Mass Hunter Data Acquisition 实时采集工作站（Version B.06.01 Build 6.01.6172 SP1），Qualitative Analysis离线分析软件（Version B.07.00 Service Pack2）。Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司产品）。

甲醇、乙腈（色谱纯）为德国Merck 公司产品；醋酸铵（色谱纯）为美国阿拉丁公司产品。安赛蜜（纯度99.8%）为美国CATO 公司产品；甜蜜素（纯度99.9%）、糖精钠（纯度85.68%）、阿斯巴甜（纯度94.49%）为德国Dr.Ehrenstorfer 公司产品；阿力甜（纯度99.4%）、钮甜（纯度95.2%）、甜菊糖苷（纯度90.4%）为北京曼哈格BePure公司产品；三氯蔗糖（纯度99.6%）为北京坛墨公司产品。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18（3.0 mm×50 mm，1.8 μm）；进样体积5 μL；流动相：A为超纯水溶液，B为甲醇溶液，梯度洗脱程序0～7 min，5%B升到50%B；7.01～9.00 min，70%B；9.01～12 min，100% B 流速0.4 mL／min；柱温不控温；平衡时间3 min。

1.2.2 质谱条件

采用鞘流双电喷雾电离源，电喷雾离子源干燥气采用高纯氮，干燥气温度和流速分别设定为300 ℃和10 L／min，雾化气压力0.2 MPa，鞘气温度350 ℃，鞘气流速10 L／min，碎裂电压130 V，毛细管电压4 kV。一级质谱离子扫描范围m／z100～1 100，扫描频率1 张／s谱图；二级质谱离子扫描范围m／z50～1 100，扫描频率2 张／s谱图，碰撞能量设为10～40 eV，延迟时间设置为1 min。

选择负离子模式下采集数据，参比离子质荷比（m／z）为1 033.988 1，每天采集数据前先使用调谐液（含125 μmol／L 三氟乙酸铵、5 μmol／L 嘌呤和1.25 μmol／L六甲氧基磷腈溶液，溶剂为乙腈∶水＝95∶5）进行质量轴的校准。

1.3 样品前处理

取50 mL样品，使用超纯水进行适当稀释，最后经过0.22 μm尼龙滤膜过滤。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 流动相的选择

流动相选择中，首先考虑了甲醇与乙腈作为有机相，发现采用同一个洗脱梯度，当乙腈作为有机相时，虽然化合物保留时间普遍提前，但是安赛蜜、甜蜜素和糖精钠的峰形较宽且分离度较差，此结果与文献［15］一致。因此选择甲醇作为有机相。

然后考察了以纯水以及水相中添加2 mmol／L 醋酸铵，5 mmol／L醋酸铵，10 mmol／L醋酸铵的水溶液对8 种甜味剂响应情况的影响。结果发现，水相加入醋酸铵溶液后色谱峰形普遍提高，但是响应强度大大减小，而且缓冲盐体系容易造成对色谱柱和泵的堵塞［16］，故选择水相中不添加缓冲盐。又因安赛蜜、甜蜜素、糖精钠、阿斯巴甜、纽甜等化合物呈碱性，容易与C18柱残留硅醇基发生吸附作用造成峰拖尾［17］，所以考虑在水相中添加体积分数为0.05%的甲酸和体积分数为0.1%的甲酸。结果发现，水相中添加甲酸后，弱酸性流动相确实改善了化合物的拖尾现象，但是化合物的响应强度大大降低，故最终选择纯水-甲醇作为流动相。经过反复优化，8 种甜味剂的提取离子流图如图1所示。

图1 8种甜味剂的提取离子流图（mg／L）

2.1.2 柱温箱温度选择

考察了柱温箱温度为20，25，30，35，40 ℃时，对8种甜味剂响应强度的影响。结果发现，5 种柱温箱温度下8 种甜味剂的响应强度无明显差别。一般认为提高柱温虽然可以缩短分析物的分离时间，但是分析物的分离度可能随之下降。所以，不特别设置柱温箱温度，柱温箱温度接近仪器室室温，即22 ℃左右。

2.2 质谱条件的优化

2.2.1 一级质谱正负离子采集范围的确定

尽管阿斯巴甜、阿力甜、纽甜在正、负离子模式下都可以得到很好的响应，但是糖精钠、甜蜜素、安赛蜜在正离子模式下响应不好，因此本文选择使用负离子电离模式采集数据。

2.2.2 一级质谱传输区电压的确定

比较了传输区电压为80，100，120，140，160，180 V时对8 种甜味剂响应强度的影响。结果发现，化合物的响应强度随着传输区电压的升高呈现先增加再降低的情况；纽甜和甜菊糖苷在180 V时响应强度最高，略高于120 V 和140 V 时的响应强度；另外6 种甜味剂在120 和140 V响应强度最高。实验又进一步考察了传输区电压为120，130 和140 V时8 种甜味剂的响应强度，综合考虑8 种甜味剂的响应情况，最终确定将传输区电压设置为130 V。

2.2.3 采集二级质谱数据提高定性能力

未避免因基质复杂而导致假阳性的情况发生，在进行一级质谱全扫描得到8 种甜味剂的精确质量数及保留时间后，将碰撞能量设置为10～40 eV，延迟时间设置为1 min，得到target MSMS 二级质谱模式下每种甜味剂的二级质谱图及其特征碎片，见表1。采集二级质谱数据进一步提高了定性能力，避免了假阳性样品情况的发生。

表1 8 种甜味剂的色谱、质谱信息、检出限和定量限

2.3 线性范围和检出限

用纯水溶液配制一系列标准样品，浓度分别为1、2.5、5、10、25、50、100 μg／L，在已优化的色谱与质谱条件下，以对照溶液的质量浓度（X，μg／L）为横坐标，以色谱峰面积（Y）为纵坐标对目标化合物进行定量。以3 倍仪器检测信噪比（S／N＝3）计算各化合物的定性筛查检出限（LOD），以10 倍信噪比（S／N＝10）计算定量限（LOQ），见表2。8 种甜味剂在相应线性范围内关系良好，相关系数R2≥0.999 0，检出限≤1 μg／L，8 种甜味剂的定量限均≤2.5 μg／L。

表2 8 种甜味剂在不同加标水平下的回收率及相对标准偏差%

2.4 加标回收试验

为考察本方法的准确性，对实际样品中添加低、中、高3 个浓度水平的目标化合物混合标准溶液，每个添加水平平行测定6 次，得到不同添加水平下8 种甜味剂的回收率和相对标准偏差。结果表明，在不同的加标水平下，8 种甜味剂的平均回收率在83.9%～111%，相对标准偏差小于3.9%，各甜味剂的回收率和相对标准偏差如表2 所示。

2.5 实际样品中安赛蜜等8 种甜味剂定性定量分析

购买市售10 份饮料，其中包括6 种碳酸饮料，分别编号1＃～6＃，以及4 种茶饮料，分别编号7＃～10＃。样品经过1.3 中步骤进行前处理，并根据优化后的测试条件进行检测。通过对该8 种甜味剂提取色谱图的峰面积进行积分，得到每种甜味剂的浓度含量，结果如表3 所示。该8 种甜味剂检出的浓度范围为0.18～291 mg／L。6 种碳酸饮料中检出5 个样品含有该8 种甜味剂，其中1＃，3＃，4＃，5＃和6＃样品中均含有安赛蜜和三氯蔗糖，其含量有较大差异。1＃样品中除含有安赛蜜和三氯蔗糖以外还含有阿斯巴甜。所有茶饮料均未检测出该8 种甜味剂。

表3 实际样品检出8 种甜味剂的含量 mg／L

2.6 实际样品中新橙皮甙二氢查尔酮等10 种甜味剂的定性分析

本研究在查阅大量文献的基础上，结合中国食品常见甜味剂的种类，利用新方法对新橙皮甙二氢查尔酮、甜菊双糖苷、爱德万甜、甘素、麦芽糖醇、D-山梨糖醇、D-甘露糖、赤鲜糖醇、甘草酸、18β-甘草酸10 种甜味剂进行了定性分析。结果发现，1＃样品中含有新橙皮甙二氢查尔酮和麦芽糖醇；3＃和4＃样品中含有D-甘露糖；5＃、7＃和8＃样品中含有麦芽糖醇；6＃样品中含有爱德万甜。

3 结语

本文建立了UPLC-QTOF-MS 直接检测碳酸饮料和茶饮料中安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、纽甜、甜菊糖苷8 种甜味剂的方法，并对市售的10 种饮料进行了检测。所测饮料样品中，5 种碳酸饮料被检出含有该8 种甜味剂，分别是安赛蜜、阿斯巴甜和三氯蔗糖，茶饮料中均未检测到该8 种甜味剂。

利用UPLC-QTOF-MS 不依靠标准品也能定性分析的特点对文献中报道过的另外10 种甜味剂进行了分析，得到了更全面而可靠的结果。

该方法简便、准确、灵敏，可为市售碳酸饮料和茶饮料中甜味剂的筛查和检测提供方法参考。