鲈鱼肠道来源降胆固醇乳酸菌分离筛选 及其益生功能评价

宋莺丽，李安章，徐帅帅，马立安，朱红惠*

（1.广东省科学院微生物研究所，华南应用微生物国家重点实验室，农业农村部农业微生物组学与精准应用重点实验室，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东广州 510070）（2.长江大学生命科学学院,湖北荆州 434025）

胆固醇与人体的健康息息相关，是人体细胞重要的组成部分，同时也是诱发心血管疾病的危险因素之一。人体胆固醇浓度过高会诱发高脂血症，进而造成胆固醇动脉壁结块、动脉粥样硬化、冠心病、脑梗、中风等严重的心血管疾病[1]。调查表明，美国每年由心血管疾病造成的经济损失高达3154亿美元[2]。据统计，预计至2030年，全球范围内死于心血管疾病的人数将达到约3000万左右[3]。虽然近年来治疗高脂血症及其相关的心血管疾病的药物不断涌现，但是这些药物普遍价格昂贵且伴有严重的副作用，长期疗效并不显著[4,5]。

益生菌是一类能定植于宿主体内且有利于宿主健康的活性微生物的总称[6]。乳酸菌因能产生抑制有害微生物的物质且有利于宿主肠道健康而作为常见的益生菌，被广泛应用于食品、保健品以及医药行业中[7]。早在2001年，世界卫生组织就提出了益生菌可有效治疗高脂血症[8]，它不仅可以降低机体的血脂水平，还能调节肠道菌群的平衡，从而降低心脑血管疾病发病的风险[9-11]。以上研究表明，筛选出具有降胆固醇功能的菌株是近几年的研究热点。黄燕燕等[12]、李雅迪等[13]利用体外筛选试验证实益生菌具有体外降胆固醇的作用；Fei等[14]、El-Gawad等[15]、Zhu等[16]利用动物模型证明了益生菌具有体内降胆固醇的作用；Jones等[17-19]、Liong等[20,21]利用一系列体外和体内试验证明了益生菌可降低机体中胆固醇的含量。益生菌降胆固醇的作用机制主要有两个观点：一个是Frand等[22]最先提出的共沉淀理论，即胆盐水解酶能将结合型胆盐水解成游离型胆盐，游离型胆盐可与胆固醇共沉淀排出体外，从而达到降低胆固醇的目的；另一个是Gilliland等[23]提出的同化吸收理论，即胆固醇能被乳酸同化并吸附在细胞膜表面，从而降低体内胆固醇的含量。

本研究从健康鲈鱼肠道中筛选既能产胆盐水解酶又能降胆固醇的乳酸菌，并对其进行菌株鉴定，通过耐酸、耐胆盐及抑菌性等指标评估菌株的益生作用，为后续体内试验及辅助降脂益生菌制剂的生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

筛选目标菌株的样品取自本实验室养殖的健康鲈鱼肠道内容物，植物乳杆菌（GDMCC 1.140）、大肠杆菌（GDMCC 1.180）、金黄色葡萄球菌（GDMCC 1.1220）、沙门氏菌（GDMCC 1.237）由广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC）提供。

1.1.2 培养基

MRS肉汤培养基：广东环凯微生物有限公司；

MRS固体培养基：在MRS肉汤培养基中添加2%的琼脂；

BSH筛选培养基：在MRS肉汤培养基中添加琼脂2%，牛胆盐0.3%，巯基乙酸钠0.2%，氯化钙0.037%；

MRS-CHOL培养基：在MRS肉汤培养基中添加3%胆盐和1%胆固醇。

1.1.3 试剂与仪器

牛胆盐、革兰氏染液，广东环凯微生物有限公司；巯基乙酸钠、胆固醇，上海麦克林生化科技有限公司；二硫苏糖醇、茚三酮，北京索莱宝科技有限公司；牛磺酸、牛磺胆酸钠、邻苯二甲醛，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三氯乙酸，国药集团化学试剂有限公司；细菌DNA抽提试剂盒，广州美基生物科技有限公司；氯化钙、氯仿、二甲苯，广州化学试剂厂。

HVE-50高压蒸汽灭菌器，日本Hirayama公司；SW-CJ-2FD洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；AEP厌氧工作箱，英国Electrotek公司；LRH-250生化培养箱，上海浦东荣丰科学仪器有限公司；3-18KS台式冷冻离心机、GSX1梯度PCR仪，德国Sigma公司；Multiskan Go酶标仪，上海巴玖实业有限公司；VCX-130超声波细胞破碎仪，美国Sonics公司；电泳仪，北京六一生物科技有限公司；ST3100 pH计，奥豪斯仪器（常州）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的分离与纯化

取1 g新鲜的样品放入9 mL灭菌生理盐水中，混合摇匀后将所得到的样品悬浊液按10倍梯度稀释，选取合适的3个稀释梯度，吸取100 µL涂布于MRS固体培养基上，37 ℃厌氧培养48 h。观察涂布平板的菌落形态特征，选择生长有50～150个单菌落的平板，根据菌落的形态特征选择不同形态的单菌落，在MRS平板上多次划线纯化，直至获得菌落形态特征一致的纯培养单菌。将分离纯化出来的菌株用25%（体积分数）的甘油于-80 ℃冷冻保存。

1.2.2 产胆盐水解酶（BSH）菌株的定性筛选与酶活力测定

1.2.2.1 产BSH菌株的定性筛选

参考滕跃等[24]、玛丽娜·库尔曼等[25]定性筛选产BSH菌株的方法，将含有目标菌株的BSH筛选培养基37 ℃培养72 h，若观察到滤纸片周围产生白色沉淀，则说明该菌株产生BSH。同时，以不产生BSH菌株作为阴性对照，以菌株GDMCC 1.140作为阳性对照。

1.2.2.2 产BSH菌株的酶活力测定

将菌株按3%的接种量接种于MRS肉汤培养基中，37 ℃培养24 h后离心10 min（8000 r/min，4 ℃）收集菌体，将收集的菌体用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）洗涤2次，在600 nm下调整菌体浓度为1.0后备用。参考Tanaka等[26]、李昵等[27]的方法测定菌株BSH酶活力，菌株GDMCC 1.140作为阳性对照，以牛磺酸浓度（μmol/mL）为横坐标，吸光值（A570nm）为纵坐标，制得牛磺酸标准曲线为：y=0.2286x-0.0041，R2=0.9923。

BSH（总）酶活定义为：单位时间、单位体积的粗酶使结合胆盐水解产生氨基酸的物质的量，单位：µmol/(h·mL)

1.2.3 体外降胆固醇能力测定

1.2.3.1 胆固醇标准曲线的绘制

参考贺珊珊等[28]的方法，以胆固醇的浓度（mg/mL）为横坐标，吸光值（A500nm）为纵坐标，制得胆固醇标准曲线为：y=24.393x-0.0125，R2=0.9944。

1.2.3.2 样品的制备与测定

将上述产BSH的菌株活化后，用未接菌的MRS肉汤培养基在600 nm下调整菌体浓度为1.0，调整后的菌悬液按照3%的接种量接种到MRS-CHOL培养基中，37 ℃培养24 h，取1 mL发酵液，8000 r/min离心10 min取上清液，以菌株GDMCC 1.140作为阳性对照，采用邻苯二甲醛法[29,30]测定上清液中胆固醇含量，按照公式（1）计算胆固醇去除率。

式中：

B——接种菌株前培养基中胆固醇浓度；

A——菌株发酵后培养基中胆固醇浓度。

1.2.4 菌株鉴定

将挑选出的胆盐水解酶活性且体外降胆固醇能力较好的菌株进行形态学观察及16S rDNA鉴定。

1.2.4.1 形态学观察

将活化好的菌株进行革兰氏染色及简单染色，镜检观察菌株的形态并拍照做记录。

1.2.4.2 16S rDNA鉴定

用DNA试剂盒提取基因组，釆用通用引物（27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和 1492R：5’-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3’）进行PCR扩增。PCR反应体系为：DNA模版1 µL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 µL，上下游引物各0.5 µL，ddH2O 10.5 µL，总体积25 µL。反应条件：预变性：94 ℃、3 min；变性：94 ℃、30 s；退火：55 ℃、30 s；延伸：72 ℃、1 min；30个循环；4 ℃终止反应。反应结束后，取3 µL反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，将扩增合格的样品送天一辉远公司或金唯智公司测序。测序得到的16S rDNA序列使用DNAMAN 8软件进行拼接后，与NCBI（National Center for Biotechnology Information）数据库进行同源序列比对初步确定其属种，再利用MEGA 7.0构建系统发育树，进一步确定筛选得到的菌株与参比菌株之间的进化关系[31]。

1.2.5 菌株耐酸性测定

分别调整MRS肉汤培养基的pH为3.0和6.0（其中pH 6.0的培养基作为对照组），将菌种按3%的接种量分别接种于上述两种培养基中，37 ℃培养0、2、4、6、8 h取样，用酶标仪测定菌株的OD600值，按照公式（2）计算菌株的耐酸存活率[32]。

1.2.6 菌株胆盐耐受性测定

以不加胆盐的MRS肉汤培养基为对照组，加入0.3%胆盐的MRS肉汤培养基为试验组，将菌株按3%的接种量分别接种于上述两种培养基中，37 ℃培养0、2、4、6、8 h取样，用酶标仪测定菌株的OD600值，按照公式（3）计算菌株的耐胆盐存活率[33]。

1.2.7 菌株疏水性的测定

参考Kotzamanidis等[34]的方法测定菌株的疏水性，在波长600 nm处测量其吸光度A，按照公式（4）计算菌株的疏水率。

式中：

A0——与氯仿（或二甲苯）混合前菌液在波长600 nm处测量的吸光值；

A——与氯仿（或二甲苯）混合后菌液在波长600 nm处测量的吸光值。

1.2.8 菌株自凝聚力测定

参考温贺等[35]的方法测定菌株的自凝聚力，将菌液在试管中静置1、24、48 h后，取1 mL上清液测定光密度值，按照公式（5）计算菌株的自凝聚力：

式中：

A0——时间为0 h时测得的光密度值；

At——时间分别为1、24、48 h时测得的光密度值。

1.2.9 代谢物抑菌性评价

参考何江波等[36]的方法，以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌为指示菌，用牛津杯法测定目标菌株的抑菌能力，将含有目标菌株的培养皿37 ℃培养24 h，观察并测量抑菌圈直径大小。

1.3 数据统计分析

采用Excel 2010和Origin 2017对数据进行整理和图表绘制，用SPASS 19.0进行差异显著性分析，当p＜0.05时，差异是有意义的，数据结果用平均值±标准差表示。

2 结果与讨论

2.1 产胆盐水解酶（BSH）菌株的定性筛选与酶活力测定

胆盐水解酶（BSH）能水解结合胆盐形成氨基酸和游离胆汁酸，游离胆汁酸能与胆固醇结合形成复合体排出体外，从而降低血液中胆固醇的含量。因此，胆盐水解酶可以作为降胆固醇菌株筛选的一个重要指标[37]。从鲈鱼肠道中共分离纯化出30株细菌，用BSH筛选培养基进行筛选，筛选结果在体视显微镜（SZX2-ILLT）下拍照观察，由图1可知，以不产BSH的菌株ZGLLu02和ZR2YLu03为阴性对照，以已报道的产BSH的菌株植物乳杆菌（GDMCC 1.140）为阳性对照，筛选出9株产BSH的菌株，菌株编号分别为DM2YLu01、DM2YLu05、DMYLu01、DMYLu03、DMYLu07、SYLu7-2、YLu-1、ZG2YLu05、ZGYLu02。由图2可知，在9株产BSH的菌株中，ZG2YLu05的BSH活性最高，其粗酶活为0.82 µmol/(h·mL)，显著高于阳性对照菌株GDMCC 1.140的粗酶活。

图1 菌株胆盐水解酶的定性筛选 Fig.1 Qualitative screening of bile salt hydrolase from strains

图2 不同菌株胆盐水解酶的定量测定 Fig.2 Quantitative determination of bile hydrolase from different strains

2.2 体外降胆固醇能力测定

如图3所示，采用邻苯二甲醛法测定上述产BSH菌株的体外降胆固醇能力。其中胆固醇去除率小于20%有3株菌，胆固醇去除率在20%～30%有5株菌，胆固醇去除率高于40%以上有1株菌，其中菌株ZG2YLu05的胆固醇去除率最高为50.09%，显著高于阳性对照菌株GDMCC 1.140和其他菌株。关于降胆固醇乳酸菌的研究中，目前研究已发现多种不同的菌株，包括植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌等多种菌株[24]。如万婧倞等[30]从喙鲸内脏中筛选出一株胆固醇去除率48.82%的植物乳杆菌，黄燕燕等[12]从开菲尔粒和陈年泡菜水中筛选出一株胆固醇去除率37.58%的植物乳杆菌。由此可见，在关于降胆固醇乳酸菌的现有研究中，菌株ZG2YLu05的胆固醇去除率处于较高水平，具有一定的研究价值，因此选取该菌株进行下一步试验。

图3 不同菌株体外胆固醇去除率 Fig.3 In vitro cholesterol removal rate of different strains

2.3 菌株鉴定

2.3.1 形态学观察

将菌株ZG2YLu05在MRS固体培养基上37 ℃培养48 h后观察菌落形态，结果如图4a、4b所示，菌株ZG2YLu05的菌落直径约0.5～2 mm，菌落湿润，为白色圆形，隆起，边缘光滑。挑取单个菌落进行革兰氏染色并在油镜100×10倍数下观察菌体形态，结果如图4c所示，菌株细胞为短杆状，单个、成对或成串聚集，无芽孢，无鞭毛，为革兰氏阳性菌。

图4 菌株ZG2YLu05的形态学观察 Fig.4 Morphological observation of strain ZG2YLu05

2.3.2 16S rDNA鉴定

用试剂盒提取菌株ZG2YLu05的基因组后，用16S rDNA通用引物进行PCR扩增，扩增产物的序列长度在1500 bp左右，扩增产物的测序结果在NCBI上做同源序列比对，用MEGA7.0构建系统发育树，结果见图5。系统发育树显示ZG2YLu05与戊糖乳杆菌的亲缘关系最近。因此，鉴定ZG2YLu05为戊糖乳杆菌。

图5 菌株ZG2YLu05的系统发育树 Fig.5 Phylogenetic tree of strain ZG2YLu05

2.4 菌株耐酸性测定

通常人体进食后胃部pH在3.0～5.0之间[38]，且食物一般在胃中只停留2～4 h[39]。如图6所示，菌株ZG2YLu05在pH 3.0的条件下，经过8 h的培养，其存活率仍高达83.33%，说明菌株ZG2YLu05对低pH的酸性环境有很好的耐受性，由此判定此菌株可以适应人体肠道酸性环境并发挥作用。

图6 菌株ZG2YLu05的耐酸性测定 Fig.6 Determination of acid resistance of strain ZG2YLu05

2.5 菌株胆盐耐受性测定

有研究发现，适当的胆盐浓度会促进乳酸菌对胆固醇的吸收[40]，而人体肠道胆盐浓度一般在0.03%～0.3%之间[41]，因此测定菌株胆盐耐受性是衡量菌株能否在肠道发挥作用的一个重要指标。如图7所示，菌株ZG2YLu05在胆盐浓度0.3%的条件下，经过8 h的培养，其存活率仍高达89.31%，说明菌株ZG2YLu05对胆盐有很好的耐受性，可以进入人体肠道并在其中发挥作用。

图7 菌株ZG2YLu05的胆盐耐受性测定 Fig.7 Bile salt tolerance determination of strain ZG2YLu05

2.6 菌株疏水性的测定

疏水性和自凝聚力与菌株对肠上皮细胞的黏附能力有关[42]，有研究表明疏水性高的乳酸菌对肠上皮细胞具有强的黏附性[43]。分别以氯仿和二甲苯为吸附剂研究菌株的疏水性，由表1可知，菌株ZG2YLu05在二甲苯中的疏水性比在氯仿中的疏水性高，达46.82%，超过了陈明等[44]筛选的菌株疏水性（31.92%），说明菌株ZG2YLu05具有较好的疏水性，有一定的黏附能力。

表1 菌株ZG2YLu05的疏水性测定 Table 1 Hydrophobicity determination of strain ZG2YLu05

2.7 菌株自凝聚力测定

菌株的自凝聚力由疏水性决定，同时与上皮细胞的黏附能力有关[45]。由表2可知，菌株ZG2YLu05的自凝聚力随着时间的延长而提高，在静置24 h后，ZG2YLu05的菌悬液上层明显呈现澄清状态，自凝聚力高达92.93%，高于玛丽娜·库尔曼等[25]研究的副干酪乳杆菌S-8的自凝聚力（88.42%），说明菌株ZG2YLu05具有良好的自凝聚力，在肠道中可以稳定定植。

表2 菌株ZG2YLu05的自凝聚力测定 Table 2 Determination of self-cohesion of strain ZG2YLu05

2.8 代谢物抑菌性评价

大量研究成果表明，乳酸菌会产生乳酸、乙酸、细菌素等代谢产物抑制肠道病原菌[46]。本研究以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌为指示菌，用牛津杯法评估菌株ZG2YLu05的抑菌能力。如表3所示，菌株ZG2YLu05对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌都有明显的抑制作用，抑菌圈直径分别为17.85、12.67和16.16 mm，其中对大肠杆菌的抑制能力最好，其次是沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，说明菌株ZG2YLu05产生的代谢物质具有一定的抑菌活性，对肠道健康具有一定的促进作用。

3 结论

3.1 血清中过高的胆固醇是引起动脉壁结块、动脉粥样硬化、脑梗、中风等心脑血管疾病的主要原因，而乳酸菌作为常见的降胆固醇益生菌，是目前研究的热点菌群。大量研究者用体外和体内试验已证实一些乳酸菌具有降胆固醇的作用。在进行降胆固醇乳酸菌的筛选试验中，菌株除了需要具备产BSH和体外降胆固醇的能力外，还应适应人体肠道的特殊环境，需要对其耐酸、耐胆盐、疏水性、自凝聚力和代谢物抑菌性进行测定，以便得到性状优良的潜在益生菌。

3.2 基于以上试验背景，本研究从健康鲈鱼肠道中分离纯化得到一株降胆固醇能力较好的菌株ZG2YLu05，其胆盐水解酶（BSH）粗酶活和胆固醇去除率分别为0.82 µmol/(h·mL)和50.09%，在现有的降胆固醇乳酸菌的研究中，其降胆固醇能力处于较高水平，具有一定的研究价值。经形态学观察和16S rDNA 鉴定其为戊糖乳杆菌（Lactiplantibacillus pentosus）。耐酸、耐胆盐、疏水性、自凝聚力和代谢物抑菌性评价的试验结果表明，菌株ZG2YLu05具有适应肠道环境并发挥作用的潜力，是一株安全高效的降胆固醇乳酸菌，可作为潜在益生菌用于后期辅助降脂益生菌制剂的研发。由于本研究仅对乳酸菌的体外降胆固醇能力进行了探究，后期还需进行动物试验更进一步验证菌株ZG2YLu05降胆固醇的能力。