脂质过氧化反应在纳米细菌损伤肾小管上皮细胞过程中的作用

杨 恒,钱 彪,刘志立,王勤章,郝志强,王敬珅,汪 渊,李永乐,谭明辉,郑丽英

(1.石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科,新疆石河子 832008；2.赣南医学院第一附属医院泌尿外科，江西赣州 341000)

肾结石是临床常见的泌尿外科疾病，严重影响患者的身体健康和生活质量[1-2]，该病的成因非常复杂。自从芬兰科学家 KAJANDER及其同事研究发现了一种直径在0.1～2.0 μm的微生物，并将其命名为纳米细菌(nanobacteria，NB)以来[3]，NB作为一种新的微生物被临床及科研人员广泛研究。NB在95%肾结石患者的血液、尿液和结石中均可检测出，有关NB的动物实验已经成功建立出了肾结石的模型[4-6]。将NB与HK-2细胞一同培养，发现NB可损伤HK-2细胞[7]，但机制不明。研究表明纳米细菌可诱导肾小管氧化应激，促进肾结石的形成[8]。本研究将采用体外培养HK-2细胞，探讨脂质过氧化反应在NB损伤HK-2细胞过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器人肾小管上皮细胞HK-2购自武汉大学保藏中心，DMEM培养基、1640培养基、胎牛血清均来自GIBCO 公司(美国)，HEPES(N’-a-hydroxythylpiperazine-N’-ethanesulfanic acid，4-羟乙基哌嗪-2-乙磺酸)缓冲液购自美国Hyclone 公司。四环素购自山西云鹏制药有限公司。过氧化氢(H2O2)试剂盒、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)试剂盒、乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase,LDH)试剂盒、Na+/K+ATP酶试剂盒、Ca2+/Mg2+ATP酶试剂盒、phalloidin-FITC均购自中杉金桥生物技术有限公司。细胞孵育箱购自美国Thermo Fisher Scientific 公司，倒置相差显微镜来自于德国蔡司，酶标仪来源于美国Bio-TEK 公司。

1.2 NB的培养与鉴定于新疆石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科收集临床确诊肾结石且未应用药物或手术治疗的患者尿液，将2 mL无菌条件下获得的尿液用生理盐水稀释5倍，4 ℃(离心力14 000 g，45 min)；再取管底2 mL混匀，以0.45 μm滤纸过滤后，再以生理盐水稀释5倍，4 ℃(离心力14 000 g，45 min)；取管底1 mL液体充分混匀后，经0.22 μm的滤纸加压过滤。将滤液1 mL注入含DMEM培养液、体积分数为10%的γ-胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和体积分数为1%的HEPES缓冲液的细胞培养瓶中，在37 ℃、体积分数为5% 的CO2条件下培养，5～7 d换1次液。倒置相差显微镜观察NB生长，筛选出无污染的标本，用吸管吹打均匀后，吸入EP管。以12 000 r/min的速度离心20 min，弃上清液，再加入无菌注射用水1.5 mL吹打混匀。重复上述步骤，共计清洗NB 3次，采用纳米细菌钙染色(Von KOSSA法)和透射电镜扫描(负染法)鉴定NB。

1.3 实验分组选取对数期生长状态良好的HK-2细胞，随机分为3组，NB组[NB菌液2 mL、PBS 20 mL、1640培养液+HK-2细胞(每孔约4×106个)]，四环素干扰组[5 mg/L四环素、NB菌液2 mL、PBS 20 mL、1640培养液+HK-2细胞(每孔约4×106个)]和空白对照组[PBS 20 mL、1640培养液+HK-2细胞(每孔约4×106个)]。

1.4 各组细胞苏木精-伊红(harris-eosin，HE)染色观察分别于实验开始后6、12、24 h提取各组细胞，每组吸取100 μL细胞悬液，使用细胞离心涂片机进行涂片，PBS冲洗3次，晾干；玻片经二甲苯脱蜡及梯度乙醇水化后，苏木精染色1 min，自来水冲洗2 min，体积分数为1%的盐酸乙醇分化5 s，伊红染色5 min；再经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封片，于光学显微镜下观察细胞形态变化。

1.5 细胞损伤因子指标检测分别在6、12、24 h取各组细胞上清液，按照试剂盒说明书分别检测H2O2、MDA、LDH含量；向吸尽培养液的细胞中加入25 g/L胰蛋白酶并反复吹打将细胞消化，转移至EP管中，分别加入PBS缓冲液400 μL。用超声粉碎机粉碎，ATP酶试剂盒比色法测定各组细胞Na+/K+ATP酶和Ca2+/Mg2+ATP酶活性。

2 结 果

2.1 各组细胞HE染色结果结果如图1所示。NB组在实验开始后，部分细胞体积增大，刷状缘排列紊乱，胞核松散，核膜模糊不清，并且此改变随时间延长，呈加重趋势；四环素干扰组在实验开始后，整体上细胞形态完好，胞核清晰，胞浆致密，少量细胞出现胞体膨胀，胞核松散，出现这种改变的细胞，随时间延长有缓慢增多的趋势；空白对照组细胞形态完好，大小均一，细胞核清晰、胞浆致密，无明显异常。

注：NB(纳米细菌)组中红色箭头表示部分细胞体积增大，四环素干扰组中6 h红色箭头表示整体上细胞形态完好，12 h及24 h红色箭头表示少量细胞出现胞体膨胀，胞核松散；对照组红色箭头表示细胞形态完好，大小均一。

2.2 各组细胞细胞损伤因子指标检测结果共培养12、24 h后，NB组细胞的Na+/K+ATP酶和Ca2+/Mg2+ATP酶活性均低于对照组(P<0.05)和干扰组(P<0.05)，干扰组细胞在各时间点的酶活性均低于对照组(P<0.05)(表1)。

表1 各时间点各组Na+/K+ATP和Ca2+/Mg2+ATP酶活性比较

共培养12、24 h后，NB组培养液中H2O2和MDA的含量显著高于对照组(P<0.05)和干扰组(P<0.05)，干扰组中H2O2和MDA的含量显著高于对照组(P<0.05)(表2)。

表2 各时间点各组培养液LDH、H2O2和MDA含量比较

3 讨 论

肾结石的病因非常复杂，与尿路异常、代谢异常和基因的特异性有关，同时与地理、气候、饮食和饮水量等也密切相关[9]。目前，关于NB与肾结石的研究发现，NB可能是导致肾结石形成的原因之一，其能够促进大鼠肾草酸钙结晶结石的形成[10]。NB是可以在人体内产生磷灰石结晶的生物，已经证实其存在于人体血液、尿及许多器官组织中[11]，可使体内多种细胞发生病理性钙化[12]，并可损伤肾小管上皮细胞[13]。细胞损伤是引起结石的关键因素，肾小管上皮细胞损伤脱落后暴露的基底膜可以吸引结晶的黏附，而坏死的细胞碎片会进一步富集参与形成结石，从而导致肾结石的发生发展[14-15]。但NB是如何导致细胞损伤的，其机制尚不明确。

本实验通过HE染色和电镜对细胞进行形态学观察。在实验开始后，NB组HK-2细胞逐渐出现损伤，并且损伤情况随时间延长呈加重趋势；四环素干扰组出现少量HK-2细胞损伤，但与NB组相比损伤明显减轻，考虑可能四环素对NB有抑制作用，该结果进一步佐证了NB可以促进肾结石形成。

以往有研究证实，脂质过氧化反应可以产生大量活性氧自由基，进而对肾小管上皮细胞造成损伤。THAMILSELVAN等[17]将LLC-PK1细胞置于500 g/L COM晶体条件下培养4 h后，观察到培养液中LDH和MDA浓度显著提升，一定浓度范围内的抗氧化剂可以有效抑制脂质过氧化反应从而减少活性氧对细胞的损伤[16-19]。本次实验中，我们通过检测ATP酶活性及培养液中LDH水平来评估细胞膜损伤程度，通过检测H2O2和MDA来确定损伤过程中有无脂质过氧化反应的参与。结果NB组培养液中H2O2和MDA的含量超过一定时间后，显著高于对照组(P<0.05)和干扰组(P<0.05)，说明在NB损伤HK-2细胞的机制中，有脂质过氧化反应的参与。同时，本次实验中，NB组细胞的Na+/K+ATP酶和Ca2+/Mg2+ATP酶活性超过一定时间后，均明显低于对照组(P<0.05)和四环素干扰组(P<0.05)，LDH水平高于对照组(P<0.05)和干扰组(P<0.05)，说明NB组HK-2细胞损伤的程度明显高于对照组和四环素干扰组。并且，在NB组中，HK-2细胞的损伤程度与发生脂质过氧化反应的程度，呈现出一致性。

在细胞损伤实验的客观指标测定中，本研究在每个时间点每组仅选择了3个样本，因此没有进行统计学分析，还需要积累更多时间点和更大样本量进行深入分析，但仅从形态学的角度仍然可以得出“NB对人肾小管上皮细胞造成损伤”的确定结论。本研究采用试剂盒直接检测H2O2、MDA含量，实验结果准确，误差较小，且前人研究已有相关文献支撑[20]。另对于脂质过氧化的检测方法也可以考虑采用化学发光法或者硫代巴比妥酸法，这样可以通过多种检测方法来证实实验结果的合理性。

综上所述，我们推论，脂质过氧化反应是NB损伤HK-2细胞的作用机制之一，HK-2细胞的损伤程度与发生脂质过氧化反应的程度呈现出一致性，脂质过氧化反应甚至可能是导致HK-2细胞损伤的主要原因，这为我们今后在结石治疗和预防方面提供了一个很好的方向。