金耳多糖的研究进展

孙 涛，姜 浩，王燕玲，王诗雨，彭雯杰，雷 鹏*，王 瑞，徐 虹，李 莎，孙达锋

（1 南京工业大学食品与轻工学院 南京 211816 2 中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所 昆明 650032）

金耳（Naematelia aurantialba）是担子菌门银耳目耳包革属的一种胶体食用菌[1-2]。它是一种稀有的食用菌，因其良好的营养价值和生物活性，故在我国常被用作传统医药和食品[3]。多糖是金耳中的主要活性成分之一。现已证明，金耳多糖（Naematelia aurantialba polysaccharide）具有多种功能，包括抗氧化、抗炎、抗肿瘤、降血脂、抗糖尿病和免疫调节等[4]。许多研究者采用不同的方法制备金耳多糖，以提高其应用价值。不同来源（金耳子实体、菌丝体发酵液、孢子发酵液）、不同提取方法（热水提取、超声提取、酶提取等方法）制备的金耳多糖的化学组成、结构及生物活性具有一定差异。本文阐述金耳多糖的制备、结构特征、生物活性以及工业应用等方面的研究进展，为金耳多糖的进一步开发提供参考。

1 金耳多糖的制备

1.1 金耳多糖的提取

获得金耳多糖的途径大致包括3 种：1） 从天然或者人工栽培的金耳子实体中提取，2） 从发酵培养的菌丝体或发酵液中提取，3） 从发酵培养的金耳孢子发酵液中提取。目前，担子菌多糖的提取方法有溶液浸提法、酶解提取法、超声提取法、微波提取法、超临界萃取法以及多方法联合[5-6]。从原理说上，以上方法均适用于金耳多糖的提取。然而，现有的金耳多糖的提取方法较为局限，主要采用以下3 种方法：水提取法、超声波提取法和酶解法。

1.1.1 子实体提取途径 金耳子实体是由金耳寄生于毛韧革菌（Stereum hirsutum）而形成的，野生金耳生长在高山栎或高山剌栎等树干上，由于人类的大肆采集和生长环境恶劣造成野生金耳资源的匮乏。近年来，刘正南等[7]将目光放在了人工栽培金耳的方向上，通过解决金耳生长困难的两个因素（其一是生长因子——金耳伴生菌，其二是其生存环境——高山栎），成功完成了金耳的引种驯化。在此基础上，不同研究者使用不同的提取方法并对金耳子实体多糖的提取工艺进行了优化（表1）。

表1 金耳子实体多糖的提取方法Table 1 Extraction method of polysaccharides from N.aurantialba fruiting body

水提取法作为一种传统的食用菌多糖提取方法，由于其具有操作简单、所需设备少等优点成为了提取金耳多糖（包括子实体多糖和菌丝体多糖）最常见的方法，然而，其存在处理时间较长、能耗高和操作温度高等问题。高观世等[8]采用热水浸提法对子实体进行处理并通过正交试验优化了提取工艺，最终金耳多糖的得率为26.19%，最优条件为热水浸提1.1 h，温度100 ℃，浸提3 次，料液比1∶40。

超声波法是一种提取食用菌多糖的新型方法，该方法提取金耳多糖的原理是利用超声波的空化效应释放大量能量从而产生的高剪切力使得金耳细胞壁破裂，最终提高金耳多糖提取产率和效率。然而，该方法存在2 个问题：1）超声波辅助提取期间的温升难以监控，这可能导致结果重现性低。2）超声波处理会降低金耳多糖的分子质量和破坏多糖的三维分子结构从而改变金耳多糖的生物活性。钟姝霞等[9]采用超声提取法对金耳子实体进行处理并通过正交试验优化了超声波浸提温度与超声波浸提功率，最终金耳多糖的得率为17.36%，提取条件为超声波处理30 min，超声波处理功率400 W，浸提时间30 min,浸提温度70 ℃，料液比为1∶80。

金耳子实体生长于树木上，其子实体上含有大量的纤维素及果胶，利用纤维素酶、果胶酶等酶可以裂解细胞使得金耳多糖被释放出来。该技术具有操作简便、特异性高、环保、高效、低能耗、操作温度低等优点。通常不破坏多糖的三维分子结构，从而有助于维持其生物活性。然而，高成本是酶提取法的主要缺点之一。此外，由于酶活性会受到多个因素的影响，如温度、溶解氧、金属离子等，因此该方法在规模化工业生产中的应用具有很大局限性。游金坤等[10]采用酶法处理金耳子实体并通过响应面试验优化了提取方法，最终金耳多糖的得率为（12.69±0.52）%，最优条件为复合酶（果胶酶和纤维素酶）添加量20.50 mg/g，液料比347∶1，提取温度52 ℃，提取时间52 min。

同样由于天然或者人工栽培的金耳子实体资源的匮乏，使得相关研究人员较少，从而导致金耳多糖提取方法较为局限，未涉及到一些更加高效、智能化的现代新兴技术，如微波辅助提取法、亚临界水提取法、三相提取法、脉冲电场辅助提取法、纳米颗粒研磨提取法和高压匀浆提取法等。寻找一种或者几种从金耳子实体中获取金耳多糖的高效新兴提取方法仍然十分重要。

1.1.2 菌丝体深层发酵途径 深层液体发酵技术常被用于蘑菇类真菌的研究[16-17]。深层发酵技术培养的菌丝体较人工栽培的子实体，具有周期短、不受季节限制、便于工业化等优点[18-20]，金耳菌丝体液体深层发酵技术具有良好的发展前景。一些研究者在菌丝体深层发酵制备金耳多糖方向做出了一些工作，致力于探索最佳发酵优化条件和提取条件。邓超等[21]以马铃薯、葡萄糖为发酵培养基，在培养14 d 后通过离心、醇沉、复溶、除蛋白、醇沉、冷冻干燥后得到了66 mg/L 的金耳多糖。董昌金[22]优化了发酵培养基的配方，发现金耳菌丝体液体深层发酵最适碳源为玉米粉，最适氮源为蛋白胨。在此条件下，通过碱提取法得到了3.136 g/L 的金耳多糖。菌丝体发酵是混菌的形式，很难分离出纯的金耳菌丝，这会造成发酵过程不稳定，产物结构不稳定等现象。

1.1.3 孢子发酵途径 银耳纲食用菌能够产生类似酵母的担孢子，无共生真菌存在时，孢子不会发育成菌丝，而是像酵母一样通过出芽的方式增殖，相较于传统食用真菌的菌丝体发酵更容易调控，这也是一种大规模制备食用菌多糖的策略[23-24]。目前，这一策略已被应用于银耳多糖的生产[25-26]。金耳孢子的深层液体发酵技术是生产有价值的胞外多糖的一种稳定并且有效的替代方法。柴红梅等[27]首次将金耳孢子应用于金耳多糖的发酵以及提取，以玉米粉、白糖、黄豆粉为培养基，最终经过发酵得到了14.3 g/L 的多糖。蒋益等[28]采用低能N离子诱变法得到了一株突变的金耳孢子，在25 ℃下培养5 d 得到2.7 g/L 的金耳多糖。Sun 等[24]在7.5 L 的发酵罐中，以40 g/L 葡萄糖和稀释了10倍的豆腐废水作为培养基，得到了最大产量为（15.02±0.40）g/L 的金耳多糖，这意味着孢子发酵法制取金耳多糖有非常乐观的工业化前景。

1.2 金耳多糖的分离纯化

上述方法处理金耳子实体、菌丝体和孢子发酵液所获得的多糖为粗多糖，其中会存在蛋白质、色素、脂质、无机盐、单糖、氨基酸等化合物[6]。由于这些化合物会对金耳多糖后续的结构解析、生物活性研究造成影响，因此，粗多糖的分离纯化工艺是提高多糖纯度的关键步骤。多糖常用分离纯化方法及其特点如表2所示。过氧化氢法和Sevag法分别是粗多糖脱色和脱蛋白最常用的化学方法[25]。之后，可使用冻融、沉淀、超滤或柱层析等方法进一步纯化多糖。在这些纯化方法中，柱色谱由于成本低和效率高，成为最常用的方法[29]。多糖可首先通过基于不同离子性质的阴离子交换色谱分离，并根据不同分子质量通过凝胶过滤色谱进一步纯化，获得具有相同聚合度和空间构象的单一多糖组分[30]。

表2 多糖常用分离纯化方法及其特点Table 2 Common separation and purification methods of polysaccharides and its characteristics

金耳多糖分离纯化工艺总结见表3。刘春卉等[11]使用H2O2法结合透析法对金耳多糖进化脱色处理，随后进一步使用Sevage 法脱蛋白，最后使用SephadexG-100 得到了精制金耳多糖TAf1、TAf2。李卫旗等[31]采用蛋白酶和Sevage 法脱蛋白、苯酚脱色获得了多糖半纯品，而后使用Sephadex G-200 得到了均一组分多糖JP-1 和JP-2。Du 等[32]使用超滤膜一步完成了脱色和除蛋白步骤，依次将金耳多糖经过DEAE-Sepharose 和Sephacryl S-500 柱层析得到了5 个组分均一的金耳多糖，分别是TAPA、TAPB、TAPC、TAPD 和TAPE。郑俊丽[33]在使用醇沉法得到粗多糖后，将粗多糖通过D101 大孔树脂脱色，通过DEAE FF 16/10 阴离子交换层析和Sephacryl S-400 HR 凝胶层析得到不同组分均一纯多糖TAP-1、TAP-2、TAP-3。不同的分离纯化方法会对金耳多糖的结构解析以及其生物活性造成很大的影响，优化并建立不同来源金耳多糖的提取分离及其纯化的方法库是一个急需解决的问题。

表3 金耳多糖的分离纯化方法Table 3 Separation and purification of N.aurantialba polysaccharide

2 金耳多糖的结构特征

担子菌多糖是一种结构复杂的天然高分子物质，其活性会受结构的影响，且据报道不同来源、不同提取方法以及不同提取条件都会造成多糖结构的差异，从而影响其生物活性[35-36]。一般来说，多糖的结构表征需要明确多糖的分子质量、单糖组成、糖苷键类型以及糖残基的连接顺序[37]。这些特征可以通过一些先进的分析仪器结合现代分析方法来确定，包括气相色谱 （GC）、高效液相色谱（HPLC）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、紫外分析、核磁共振（NMR）、原子力显微镜（AFM）和扫描电镜（SEM）等[38]。不同来源的金耳多糖结构特征见表4。

刘春卉等[11]采用了薄层层析、柱层析和FT-IR法初步探究了子实体多糖的多糖组成。薄层层析结果表明，子实体多糖由木糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸等单糖组成；SephadexG-100 柱层析的结果表明，金耳多糖的分子质量范围为3.0×105～5.0×105u；FT-IR 的结果表明金耳多糖存在吡喃环，α-（1→3）和β-糖苷键。Du 等[32，39-40]采用FT-IR 和NMR 分别探究了两种均一组分（TAPA1和TAPB1）的金耳多糖的多糖结构。结果表明两种多糖在单糖种类保持一致，均含有甘露糖、木糖和葡萄糖醛酸，然而在单糖比例上有所区别。在糖苷键的连接方式上，两种多糖的主要连接方式都为α-（1→3）-甘露糖。由于金耳多糖的分子质量过大，导致结构难以解析，Yuan 等[34]使用自由基对金耳多糖进行解聚处理得到低分子质量的金耳多糖，然后运用NMR 技术对低分子质量的金耳多糖的结构进行了详细地解析。结果显示，金耳多糖主链的连接方式为α-（1→3）-甘露糖-α-（1→2），侧链由β-木糖和β-葡萄糖醛酸形成的链连接到α-甘露糖的C-2 位置，乙酰基连接到甘露糖的第6个羟基位置。

从表4中可以发现一个有意思的现象，来源于金耳子实体和孢子发酵液的金耳多糖其主要单糖组成主要为木糖、甘露糖和葡萄糖醛酸，而来源于金耳菌丝体的多糖其主要单糖组成和上述两种不一致且自身有无规律可言，这是因为菌丝体发酵是混菌的形式很难分离出纯的金耳菌丝，会造成发酵过程不稳定，产物结构不稳定。综上所述，来源于金耳孢子的发酵型金耳发酵多糖更有替代金耳子实体提取型金耳多糖的潜力。

表4 不同来源的金耳多糖的结构特征Table 4 Structural features of N.aurantialba polysaccharide from different sources

目前对金耳多糖的分子质量、单糖组成、糖苷键连接方式等结构的研究结果存在差异，这可能是由于多种因素影响造成的，如多糖来源、子实体产地、样品生长状态、提取方法、分离纯化方法等。

3 金耳多糖的生物活性

从金耳中分离出的结构多样的多糖已被众多研究者证明具有多种生物活性，包括免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、降血糖血脂等作用[4]。本文对国内外关于金耳多糖生物活性的研究成果进行归纳总结，旨在为金耳多糖的进一步研究提供理论基础。

3.1 免疫调节及抗肿瘤作用

金耳多糖最主要的生物学活性就是能够加强机体的免疫功能[42]。近年来，研究学者通过大量的试验对比后发现，以最常使用的小白鼠为对象，金耳多糖能显著增强小白鼠细胞的吞噬能力和免疫能力，并且发现机体免疫调节的效用和金耳多糖的使用量成正比[43-44]。同样，也有一些研究员将粗多糖的提取用在动物实验中，观察其免疫调节作用，结果显示皮下注射会稍逊于口服所获得的效果[45]。Yuan 等[34]发现TAP-3（金耳子实体多糖）具有明显的免疫增强活性，可促进巨噬细胞分泌NO，IL-1β 和TNF-α。TAP-3 的关键膜受体被鉴定为TLR4，其链长对其免疫调节活性至关重要。

癌症是现代社会最严重的疾病之一，其具有高发病率和高死亡率[46]。在小鼠肿瘤模型中通常使用腹腔注射法和口服法来评价多糖抑制肿瘤的效果[46]，苑小林等[12]发现腹腔注射的抑瘤效果更佳。

金耳多糖的免疫调节及抗肿瘤作用机制如图1所示，金耳多糖可以通过激活且增强吞噬细胞的活性，促进细胞因子和细胞毒性成分的释放，进而发挥其免疫调节和抗肿瘤作用。

图1 金耳多糖的免疫调节及抗肿瘤作用机制Fig.1 Immune regulation and anti-tumor mechanism of N.aurantialba polysaccharides

3.2 抗氧化作用

邓云霞等[47]的研究表明，金耳多糖不仅可以通过增强红细胞的羟自由基清除能力抑制红细胞溶血，而且能够通过降低肝细胞内的丙二醛含量抑制肝线粒体肿胀。王宣东[30]研究发现金耳多糖具有优良的清除DPPH 自由基和羟自由基的能力且在一定质量浓度范围（0～1 500 μg/mL）内金耳多糖的抗氧化能力与添加量成正比。Du 等[32]发现金耳子实体提取多糖TAPB1 具有清除超氧阴离子自由基和H2O2的能力。

活性氧（ROS）是一类由氧组成或包含氧并且在自然界中具有活性的物质。体内常见的ROS 包括超氧阴离子（O2-），过氧化氢（H2O2），高活性羟基（-OH），脂质过氧化物和氮氧化物等[46]。很多疾病都是由于氧化应激造成的，具有抗氧化作用的物质——金耳多糖可以改善这种情况。金耳多糖的抗氧化作用机制如图2所示。金耳多糖通过显著提高抗氧化活性物质【如过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）等】水平，清除活性氧（ROS）自由基，从而降低脂质过氧化产物如丙二醛（MDA）的含量，表现出较高的抗氧化活性。

图2 金耳多糖的抗氧化作用机制Fig.2 Antioxidant mechanism of N.aurantialba polysaccharides

3.3 降血糖及降血脂作用

苏槟楠等[48]发现，金耳发酵液多糖会降低家兔的血糖升高数值，表现为血糖波动不大，表明金耳多糖具有降血糖的作用。翟伟菁等[49]和Kiho等[50]发现金耳多糖的降血糖机制为使葡萄糖代谢加速，即在不影响磷酸果糖激酶的同时，金耳多糖会降低葡萄糖-6-磷酸酶的活性，令高血糖大鼠肝中的已糖激酶活性到明显提高。汪虹[51]发现金耳菌丝体多糖可以有效降低小鼠血液中胆固醇和甘油三酯的含量。金耳多糖的降血糖及降血脂的作用机制如图3所示，金耳多糖在调节肠道菌群、改善宿主代谢和调节细胞信号通路等几个方面，发挥了降血糖以及降血脂的作用，而更加深入和具体机制尚不清楚。

图3 金耳多糖的降血糖及降血脂作用机制Fig.3 Hypoglycemic and hypolipidemic mechanism of N.aurantialba polysaccharides

3.4 其它作用

金耳多糖还具有抗炎症[52-53]、抗辐射[54]、抗血栓[55-56]、护肝[57-58]、祛痰止咳[59-60]、促进造血[61]和改善肠胃道[62]等生物活性。目前，关于金耳多糖生物活性研究仍然处于初级阶段，主要是因为其研究方面较广但是深度不够。为了加强金耳多糖的理论基础，可以使用生物学模型并结合现代技术如代谢组学、转录组学以及蛋白组学等方法进一步研究并评价金耳多糖的生物活性。

4 金耳多糖在食品行业的应用

金耳多糖具有许多良好的生理、药理效用，在现在市面上能看到的以金耳多糖为原料开发出的食品中，保健产品在其中占据较大的比例。

4.1 金耳多糖饮料

1） 创新型营养保健饮料 这种新型营养保健饮料以优质量的金耳菌种作为主要的原料。李艳琴[63]研究出了其最佳的发酵条件，在此条件下发酵得到的粗多糖菌丝较多、味淡，发酵液呈现金黄色，同时还具有蜂蜜与苹果的气味。

2） 金耳液发酵饮料 金耳发酵液不易腐败、香味浓厚，能够保持长时间不变色[64]。用相关原料制成的培养基在合适的温度、碳氮比、酸碱度等条件下进行发酵培养得到代谢产物和培养物，然后调节其酸甜比例和改良基质，这样得到的金耳发酵液十分适合制成饮料。这种饮料的品质优良，金耳的活性多糖含量极高，也具有良好的保健效益，能止咳化痰，具有很高的营养价值[65]。

3） 金耳发酵豆乳 雷鹏[66]以金耳为发酵菌株制备了一种富含金耳多糖、蛋白质、膳食纤维等营养物质的金耳发酵豆乳。

4.2 金耳多糖咀嚼片

严明[67]发明了一款以金耳多糖为原料的咀嚼片，该咀嚼片具有味道清新、能增强免疫功能等优点。

4.3 食品添加剂

高观世等[68]研究发现，当金耳子实体的粗多糖含量达到一定数值（质量分数：l%～3%）后，可以作为一种功能型食品添加剂以改善面团的胶体性能，增加面团的吸水性和持水性，使面包口感柔软。

5 结语

金耳作为一种中国独有的、珍稀的胶质食用真菌，其富含各种活性物质，其中最主要的成分为金耳多糖，金耳多糖具有多种生理功能如免疫调节、抗炎症、抗氧化和抗肿瘤功能。国内外学者对于金耳多糖的研究多集中于探究子实体多糖的提取、纯化和生物活性。然而，金耳子实体多糖的研究仍然存在一些问题，如金耳子实体多糖的结构仍然不够清晰，其原因包括但不限于：1）金耳子实体是由金耳与伴生菌共同发育而来，其产生的金耳多糖为非均质多糖，含有大量纤维素、半纤维素等物质，这给金耳子实体多糖的结构解析增加了很多困难；2）多糖来源、子实体产地、样品生长状态、提取方法、分离纯化方法等不同造成金耳子实体多糖的结构具有一定的差异。

深层液体发酵有很大的研究前景，其具有发酵时间短、多糖性质稳定、提取工艺简单等优点。然而，目前利用发酵法制备金耳多糖的研究比较少。综上所述，金耳多糖未来应着眼于优化并建立不同来源金耳多糖的提取分离及其纯化的方法库，加强金耳多糖结构研究及其活性评价，在分子以及细胞水平上解析金耳多糖的作用机制，在金耳深层液体发酵技术的基础上开发适合工业化生产金耳多糖的工艺，开发更多的金耳多糖产品，使其走进人们的生活中，改善人们的生活品质。