miR-21靶向调控PTEN/PI3K/Akt通路对胆管癌细胞恶性生物学行为的影响

施 喆, 周丽媛, 赵国栋, 孙树刚, 薛 亮

河北工程大学附属医院 a.普外科， b.妇科， 河北 邯郸 056000

胆管癌源是肝胆系统中高度致命的恶性肿瘤，近年来全球范围内发病率不断上升[1-2]。目前胆管癌病因尚不明确，手术切除是其主要的根治性手段。但由于胆管癌早期症状不明显且诊断困难，大多数患者初诊时已处于晚期，总体手术切除率极低[3]。此外，胆管癌具有高侵袭转移性，恶性进展迅速，导致总体预后差、病死率高，严重威胁人类健康[4]。因此探索新的胆管癌治疗方式具有重要意义。已知肿瘤的发生和发展是由多基因调控，其中原癌基因和抑癌基因的激活与失活发挥重要功能[5]。随着肿瘤细胞增殖凋亡研究深入，多数原癌基因、抑癌基因及其信号转导通路成为肿瘤靶向治疗的关键点[6]。蛋白酪氨酸磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)/磷酸肌醇-3-激酶(phosphoinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信号通路在恶性肿瘤细胞的增殖分化过程中起重要作用[7]。PTEN是目前公认的抑癌基因之一，研究[8]表明过表达PTEN可抑制PI3K/Akt信号通路并抑制胆管癌细胞迁移能力。微小核糖核酸(micro ribonucleic acid，miRNA)可靶向调控基因转录后翻译或使其降解，研究[9-10]表明miRNA-21(miR-21)参与胆管癌细胞增殖、分化、凋亡、迁移和侵袭，并具有抑制结直肠癌的增殖和调控PTEN/PI3K/Akt通路的作用。然而miR-21能否通过靶向PTEN/PI3K/Akt信号通路调控胆管癌细胞的恶性生物学行为仍不清楚。鉴于此，本研究选取人胆管癌细胞株QBC939开展细胞实验，揭示miR-21靶向PTEN/PI3K/Akt通路调控人胆管癌细胞株QBC939恶性行为的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验细胞与试剂 人胆管癌细胞株QBC939(由武汉细胞研究所提供)；脂质体转染(LipofectamineTM2000)试剂盒(购自北京索莱宝科技有限公司，生产批号：11668-027)；人miR-21模拟物(hsa-miR-21 mimics，合成序列：5′-UAGCUUAUCAGCUGAUGUUGA-3′)(pGFP-hsa-miR-21 mimics)过表达质粒、hsa-miR-21抑制剂(hsa-miR-21 inhibitor，合成序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′)(pGFP-hsa-miR-21 inhibitor)质粒、hsa-miR-21 inhibitor阴性对照(negative control inhibitor，NC inhibitor，合成序列：5′-CAGUACUUUUGUGUAGUAGUACAA-3′)(pGFP-NC inhibitor)质粒、miR-21 mimics、miR-21 mimics阴性对照(negative control mimics，NC mimics)(合成序列：5′-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3′)[均由和元生物技术(上海)股份有限公司合成]；四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)溶液(购自上海麦克林生化科技有限公司，生产批号：M864643)；凋亡检测试剂盒(购自杭州诺扬生物技术有限公司，生产批号：FXP023-020-20)；基质胶(Matrigel)(购自上海慧颖生物科技有限公司，生产批号：356234)；侵袭小室(Transwell)(购自北京明阳科华生物科技有限公司，生产批号：BD-353503)；miR-21、PTEN、PI3K、Akt、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)和内参β-肌动蛋白(β-actin)基因所需实时-逆转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription polymerase chain reaction，RT-qPCR)引物、野生型和突变型PTEN-3′UTR引物(均由重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司合成)；总RNA提取试剂盒[购自天根生化科技(北京)有限公司，生产批号：DP419]；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度测定试剂盒(购自北京索莱宝科技有限公司，生产批号：PC0020)；兔抗人PTEN、PI3K、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、mTOR和β-actin单克隆抗体(一抗)、羊抗兔PTEN、PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和β-actin荧光标记多克隆抗体(二抗)(均购自上海联迈生物工程有限公司，生产批号：H00005728-K、ab226826、PAB1310、PAB19236、PAB18865、ab179467、ab195056、ab40755、ab372015、ab531250、5048S、ab11003)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒[购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司，生产批号：11401]；PureLinkTMPro 96基因组脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)提取试剂盒(购自赛默飞世尔科技公司，生产批号：K182104A)；不产色链霉菌第二型(Streptomyces achromogenes Ⅱ，Sac Ⅱ)和流感嗜血杆菌d第三型(Haemophilus influenzae d Ⅲ，Hind Ⅲ)内切酶(均购自北京博迈斯科技发展有限公司，生产批号：R0157S、R0104V)；pmiRGLO载体(购自湖南科爱医疗器械有限公司，生产批号：VT1439)；质粒提取试剂盒(购自上海力敏实业有限公司，生产批号：12145)。

1.1.2 实验设备 MTP-601F型酶标仪[购自天美(中国)科学仪器有限公司]；Agilent NovoCyte Quanteon型流式细胞仪[购自安捷伦科技(中国)有限公司]；BD-YG3002型荧光显微镜(购自深圳市博视达光学仪器有限公司)；TS100型倒置显微镜(购自武汉医捷迅安商贸有限公司)；H12943型划痕仪(购自北京恒奥德仪器仪表有限公司)；MA-6000型PCR仪(购自苏州雅睿生物技术股份有限公司)；MS型实时凝胶电泳系统(购自北京兴联商贸有限公司)；Image J v1.8.0软件(购自美国国立卫生研究院)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染 将人胆管癌细胞株QBC939接种至含10%胎牛血清的无菌1640液体细胞培养基(RPMI-1640)中，37 ℃、5% CO2恒温箱培养。将培养至对数期的癌细胞接种至6孔板，待细胞贴壁至70%左右时更换培养液。以LipofectamineTM2000脂质体法进行转染，严格按照试剂盒说明进行操作：加入转染试剂后，逐滴加入hsa-miR-21 mimics过表达报告基因质粒，培养4～6 h后更换培养基继续培养48 h，将该组细胞记为过表达组；同法获得转染hsa-miR-21 inhibitor报告基因质粒和NC inhibitor报告基因质粒的QBC939细胞，分别记为沉默组和空载组；同时将未经处理的QBC939细胞株记为空白对照组。每组5个复孔，并通过荧光显微镜检测转染效率。

1.2.2 MTT比色法检测各组细胞增殖抑制率 胰蛋白酶消化，每孔加20 μL 5 mg/mL MTT溶液，4 h后弃培养液，加入150 μL二甲基亚砜，振荡5 min，在酶标仪上用490 nm波长测定OD值，计算0～72 h每组细胞增殖活性。每组实验重复3次，取OD的平均值。

1.2.3 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率 胰蛋白酶消化，离心，预冷磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞，调整细胞浓度1×106个/mL。加入10 μL磷脂结合蛋白V避光室温反应10 min，预冷PBS洗涤，加入4 μL碘化丙啶，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4 Transwell实验检测细胞侵袭能力 向Transwell中加60 μL 1.5 mg/mL的Matrigel，均匀铺在小室上层滤膜，37 ℃孵育1 h成膜以模拟基底膜结构。调整细胞浓度为1×105个/mL，将细胞加入Transwell小室上室内，每孔200 μL，下孔加入RPMI-1640培养基后于37 ℃、5% CO2恒温箱培养24 h。随后分别经过PBS洗涤、多聚甲醛固定、蒸馏水洗涤结晶紫染色以及洗涤风干等步骤后获取基底膜。倒置显微镜下分4个区域，每个区域随机选取1个视野，观察拍照并计数。每组3张膜，穿膜细胞数取平均值。

1.2.5 细胞划痕实验 将各组细胞接种到6孔板中，细胞达到95%融合，用划痕仪对准6孔板下端中央部位轻轻划痕。RPMI-1640培养基轻轻漂洗3次后，37 ℃、5%CO2恒温箱培养48 h，倒置显微镜拍照，观察划痕愈合情况。

1.2.6 RT-qPCR检测miR-21、PI3K、Akt、mTOR和PTEN mRNA表达 提取各组细胞总RNA。逆转录合成cDNA，根据引物序列进行PCR反应。反应条件：95 ℃ 5 s变性；55 ℃ 30 s退火；72 ℃ 30 s，40个循环；72 ℃10 min。引物序列见表1。本研究选取β-actin作为内参基因，采用相对定量法[11]比较各组细胞待测基因mRNA表达差异。待测基因ΔΔCt值=[待测基因mRNA平均Ct值(转染组)- β-actin mRNA平均Ct值(转染组)]-[待测基因mRNA平均Ct值(空白对照组)- β-actin mRNA平均Ct值(空白对照组)]。以2-ΔΔCt表示各组待测基因 mRNA表达的倍比关系。

1.2.7 蛋白质免疫印迹法(Western blotting，WB)检测PTEN、PI3K、Akt和mTOR蛋白表达 收集各组细胞，加入细胞裂解液，提取细胞总蛋白质。BCA法测定蛋白浓度，调整蛋白终浓度为5 μg/μL。WB凝胶电泳，然后转移至聚偏二氟乙烯膜，脱脂奶粉封闭，加入一抗，4 ℃孵育过夜，将聚偏二氟乙烯膜置于含有二抗试管中，室温孵育，显色反应，扫描胶片后用Image J软件分析蛋白印迹灰度值。

表1 PCR反应引物序列Table 1 The primer sequences of PCR reaction

1.2.8 双荧光素酶报告基因实验 采用TargetScan数据库[12]预测miR-21的靶基因。构建野生型和突变型PTEN-3′UTR报告基因质粒。野生型PTEN-3′UTR报告基因质粒：获取细胞总DNA后，根据设计好的引物(引物包含Sac Ⅱ和Hind Ⅲ酶切位点)，以细胞总DNA为模板经2次PCR扩增出所需片段；对琼脂糖电泳回收的PCR扩增条带进行Sac Ⅱ和Hind Ⅲ双酶切，同时将报告质粒pmiRGLO进行双酶切，回收两者双酶切电泳条带；连接两者双酶切产物；将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中；选取合适单菌落，提取重组质粒，经鉴定序列信息与NCBI数据库收录序列一致。野生型PTEN-3′UTR引物序列：上游引物5′-CCACCAGAGCTCTCTTGTGCTGTGCAGCAG-3′，下游引物5′-CCAACGAAGCCTGTGATGGCATTCACTGAACC-3′。突变型PTEN-3′UTR报告基因质粒：通过引物搭桥法对PTEN-3′UTR进行定点突变，用设计好的上下游引物分别PCR扩增出PTEN-3′UTR上游和下游突变产物；搭桥PCR程序进行搭桥连接，以搭桥PCR产物为模板，PCR扩增并电泳回收，后续过程同野生型PTEN-3′UTR报告基因质粒构建过程一致，经鉴定连接产物的序列一致。突变型PTEN-3′UTR引物序列：上游引物5′-AACCGCGGTAAGAGAAATAAGCACCGTTTTCCAAG-3′，下游引物5′-AAAACGGTGCTTATTTCTCTTACCGCGGTTCAGATGTCTGAAGAT-3′。将野生型和突变型PTEN-3′UTR报告基因质粒、miR-21 mimics及NC mimics转染至QBC939细胞中，48 h后进行双荧光素酶检测。各组相对荧光强度=各组萤火虫荧光强度/海肾荧光强度。

2 结果

2.1 各组细胞转染效率 荧光显微镜下观察，转染成功细胞表达绿色荧光，未转染成功细胞无荧光。空载组、过表达组和沉默组转染效率分别为(90.27±18.03)%、(91.43±18.26)%和(92.16±18.41)%(图1)。

图1 转染后QBC939细胞荧光图(×100)

2.2 各组细胞增殖活性和凋亡率 MTT 结果显示，在转染处理后24～72 h，与空白对照组和空载组比较，过表达组QBC939细胞增殖活性明显提高(P值均<0.05)(图2)，凋亡率显著下降(P值均<0.01)(图3，表2)；与空白对照组、空载组和过表达组比较，沉默组细胞增殖活性显著降低(P值均<0.01)(图2)，而凋亡率显著上升(P值均<0.01)(图3，表2)。

图2 各组QBC939细胞增殖活性

表2 各组QBC939细胞凋亡率Table 2 The apoptosis rates of QBC939 cells in each group

2.3 各组细胞迁移和侵袭活性 与空白对照组和空载组比较，过表达组QBC939细胞迁移率和穿膜数目均显著增高(P值均<0.01)；与空白对照组、空载组和过表达组比较，沉默组迁移率和穿膜数目均显著下降(P值均<0.01)(表3，图4、5)。

表3 各组QBC939细胞体外侵袭实验结果Table 3 Results of in vitro invasion experiments of QBC939 cells in each group

2.4 各组细胞miR-21、PI3K、Akt、mTOR和PTEN mRNA表达 与空白对照组和空载组比较，过表达组miR-21、PI3K、Akt和mTOR mRNA表达均升高，PTEN mRNA表达下降，差异均有统计学意义(P值均<0.05)；与空白对照组、空载组和过表达组比较，沉默组miR-21、PI3K、Akt和mTOR mRNA表达均下降，PTEN mRNA表达升高，差异均有统计学意义(P值均<0.05)(图6)。

图3 流式细胞检测各组QBC939细胞凋亡率Figure 3 Flow cytometry examined apoptosis rates of QBC939 cells in each group

图4 划痕实验结果

图5 Transwell小室试验结果(结晶紫染色，×100)

注：与空白对照组比较，#P<0.05；与空载组比较，△P<0.05；与过

2.5 各组细胞PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和PTEN蛋白表达 与空白对照组和空载组比较，过表达组PI3K、Akt、p-Akt和mTOR蛋白表达均显著升高，PTEN蛋白表达显著下降(P值均<0.01)；与空白对照组、空载组和过表达组比较，沉默组PI3K、Akt、p-Akt和mTOR蛋白表达均显著下降，PTEN蛋白表达显著升高(P值均<0.01)(图7，表4)。

2.6 miR-21靶向PTEN的验证 TargetScan数据库预测PTEN为miR-21潜在靶基因，PTEN基因3′UTR与miR-21有6个碱基位点互补配对(图8)。双荧光素酶报告基因实验显示，miR-21 mimics和野生型PTEN-3′UTR质粒共转染细胞的相对荧光强度较NC mimics和野生型PTEN-3′UTR质粒共转染细胞显著降低(P<0.05)；miR-21 mimics和突变型PTEN-3′UTR质粒共转染细胞中相对荧光强度较NC mimics和突变型PTEN-3′UTR质粒共转染细胞差异无统计学意义(P>0.05)(图9)。

图7 各组细胞PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和PTEN蛋白表达量Figure 7 Expression levels of PI3K, Akt, p-Akt, mTOR,and PTEN proteins in each group

图8 数据库预测miR-21和PTEN的互补序列

3 讨论

胆管癌作为高度恶性的实体肿瘤，其传统手术切除率低，患者预后差，严重威胁人类健康。现如今靶向药物的开发和应用为肿瘤治疗提供了新的思路。既往研究[8-10]表明miR-21可调控抑癌基因PTEN表达，而PTEN/PI3K/Akt信号通路在胆管癌增殖分化过程中发挥重要作用。然而miR-21能否靶向PTEN/PI3K/Akt信号通路调节胆管癌恶性行为未知。鉴于此，本研究选取胆管癌细胞株QBC939，研究miR-21基因干扰靶向PTEN/PI3K/Akt信号通路调节胆管癌恶性行为的分子机制。

表4 各组细胞PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和PTEN蛋白相对表达量Table 4 Relative expression levels of PI3K, Akt, p-Akt, mTOR, and PTEN proteins in each group

注：与转染NC mimics细胞比较，P<0.05。

本研究结果显示,在QBC939细胞中过表达miR-21可增加细胞的增殖活性、减少细胞的凋亡并提高细胞的迁移率和穿膜数目；当沉默miR-21后，细胞的增殖活性降低、细胞凋亡率增加、迁移率和穿膜能力降低。说明miR-21过表达可显著促进癌细胞增殖、迁移和侵袭，抑制癌细胞凋亡，促进胆管癌细胞恶性行为。有研究[13]指出，胆管癌细胞高增殖率和低凋亡率与胆管癌细胞活性增强相关，癌细胞迁移和侵袭与基质金属蛋白酶9和波形蛋白的表达水平相关，据此推测本研究中miR-21调节胆管癌细胞的增殖活性、凋亡率、迁移和侵袭行为可能与调节癌细胞的细胞活性、基质金属蛋白酶9以及波形蛋白表达水平相关。

为进一步明确miR-21是否能作用于PTEN/PI3K/Akt通路，进而调控胆管癌细胞的增殖、迁移和浸润等恶性行为，本研究发现当转染miR-21 mimics过表达miR-21时，PI3K、Akt和mTOR mRNA和蛋白质表达水平均升高，而PTEN mRNA和蛋白质表达水平均下降，说明活化miR-21可增加PI3K/Akt通路的活性。当抑制miR-21表达时，PI3K、Akt和mTOR mRNA和蛋白质表达水平均下降，PTEN mRNA和蛋白质表达水平均升高，表明抑制miR-21可抑制PI3K/Akt 通路的活性。一般Akt的激活都是磷酸化的途径，总量基本稳定，但p-Akt水平改变。但是在本研究中，随着miR-21的过表达或沉默，Akt总量也发生了改变。既往研究[14]表明，泛素化是一种对靶蛋白进行特异性修饰的过程，可调控细胞增殖、细胞周期、凋亡等多种进程，泛素-蛋白酶体系统在肿瘤进程中发挥重要作用。据此推测miR-21可能通过泛素化干扰了Akt蛋白的降解过程，过表达miR-21导致Akt降解受阻，Akt总量增加，而沉默miR-21促进Akt的降解导致总量下降。也可能是miR-21影响了Akt蛋白的表达。

本研究中双荧光素酶结果显示，miR-21 mimics可显著抑制野生型PTEN-3′UTR质粒转染细胞相对荧光强度，但是对突变型PTEN-3′UTR质粒转染细胞无影响，证明PTEN为miR-21的直接作用靶点。近年来肿瘤靶向治疗逐渐重视miRNA的靶向作用[15]。miRNA是一种非编码单链小分子RNA，作为转录后负调节因子，可与靶基因mRNA互补，结合到靶基因mRNA的3′UTR，抑制靶标基因蛋白翻译或使其降解，参与原癌和抑癌基因的调节作用，调节细胞代谢过程[16]。miR-21由22个核苷酸组成，参与癌症的发生发展，在肿瘤中呈过表达现象[17]。有研究[18-19]报道miR-21可促进乳腺癌的增殖和转移，参与调控食管鳞癌细胞增殖和凋亡。PI3K是一种磷脂酰肌醇激酶，Akt是一种蛋白激酶，mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，三者均参与细胞的增殖、分化和凋亡；活化的PI3K磷酸化Akt，p-Akt水平升高，使Akt处于活化状态，在肿瘤中PI3K/Akt信号通路被异常激活后促进肿瘤细胞的增殖、迁移，促进肿瘤生长，是肿瘤靶向治疗的关键分子，同时mTOR可活化PI3K/Akt信号通路[20-21]。PTEN作为抑癌基因，可抑制胆管癌细胞生长并负调节PI3K/Akt信号通路；而PTEN表达被抑制时，PTEN/PI3K/Akt信号转导通路失衡进而促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移并抑制凋亡，最终导致肿瘤发生[22-23]。有研究[24]证明miR-21可调节PTEN/PI3K/AKT信号通路调控卵巢癌细胞的增殖和凋亡。本研究结果与既往研究结果一致，据此推测miR-21可能通过靶向抑制抑癌基因PTEN的表达，从而诱导PI3K/Akt磷酸化，促进癌细胞的侵袭和转移，增强胆管癌的恶性行为。

综上所述，miR-21基因干扰可有效抑制胆管癌细胞的恶性行为，具体机制可能通过靶向调控PTEN/PI3K/Akt信号通路信号传导，抑制癌细胞的增殖、侵袭和迁移，促进癌细胞凋亡。为进一步研究miR-21对胆囊癌细胞恶性生物学行为提供了一定理论依据，针对miR-21的小分子抑制剂有望成为潜在的胆管癌治疗方案。

伦理学声明:本研究于2019年9月27日通过河北工程大学附属医院伦理委员会批准，批号为2019[K]-042。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：施喆负责课题设计，研究实施，数据分析以及论文撰写；周丽媛、赵国栋负责资料收集，数据分析；孙树刚、薛亮负责课题设计，研究指导，论文修改。