锻造态Mg-Zn-Zr/-Y镁合金体外生物相容性研究

许东光，马春华,2,3*，冷玉敏,3，杨浩

（1.南阳师范学院 机电工程学院，河南南阳 473061；2.重庆大学 材料科学与工程学院，重庆 400044；3.河南省稀土合金材料工程技术研究中心，河南南阳 473061；4.南阳师范学院 化学与制药工程学院，河南南阳 473061）

由于镁合金在人体内具有原位降解的能力，其生物相容性、骨传导性有能力积极刺激人体新骨骼的形成，优良的强度、延展性、抗疲劳性和生物耐腐蚀性是镁合金作为生物降解种植体在骨科应用中的重要前提，是一种发展潜力巨大的骨修复金属材料。近年来，Mg-Zn-Zr镁合金，特别是ZK40（Mg-4Zn-0.5Zr）和ZK60（Mg-6Zn-0.5Zr）镁合金由于具有良好的生物安全性和生物相容性受到广大研究学者的关注。除了上述商用镁合金系列外，研究者还开发了新的镁合金用于骨科领域，包括Mg-Ca、Mg-Sr、Mg-Zn和Mg-RE合金系列[1]。

以往的研究表明[2-8]，营养元素（如Ca、Sr、Zn、Si和Mn）和微量无毒元素（如Zr、Nd和Y）单独或一起添加到Mg基质中，不会造成有害的局部组织反应，易被周围组织吸收。基于溶血和MC3T3-E1细胞粘附试验结果表明，Mg-6Zn合金具有良好的体外生物相容性[9]。YU等[10]对挤压态Mg-6Zn镁合金的体外生物相容性进行了评价，发现当Mg-6Zn镁合金植入兔子的肠道1、2和3周后，能够上调体内闭合蛋白（Occludin）和紧密连接蛋白（ZO-1）的表达，并促进周围肠道组织紧密连接的再生。

因此，本文通过pH测试、合金体外溶血率测试、CCK-8细胞毒性试验以及细胞形态观察等方法对锻造态Mg-Zn-Zr和Mg-Zn-Zr-Y镁合金的体外生物相容性进行了探讨研究，以确定其作为可降解生物医用金属材料的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

本实所用基础材料为洛阳迈格镁业有限公司提供的纯镁和锻造态镁合金板材，纯镁板的纯度为99.98%，锻造态镁合金板材的名义成分为Mg-5.45Zn-0.38Zr（质量分数，%)和Mg-5.45Zn-0.38Zr-0.73Y（质量分数，%)，经过合金配比—熔铸—板坯—轧制生产工艺制成。纯镁及锻造态镁合金板材的实际化学成分如表1所示。

表1 纯镁及锻造态镁合金的实际化学成分

1.2 仪器与试剂

FA1004电子天平，上海天平仪器厂；HM350A电火花线切割，深圳海玛数控有限公司；WD-9415B超声波清洗器，北京市六一仪器厂；Nikon D3300数码相机，日本尼康公司；DX708D金相显微镜，上海上光新光学科技有限公司；CMT5305微机控制电子万能试验机，美斯特工业系统（中国）有限公司；400HBS-3000数显布氏硬度计，莱州华银实验仪器有限公司；D8 ADVANCE型X射线多晶衍射仪，德国布鲁克公司；ZEISS Sigma 500场发射扫描电子显微镜，德国蔡司公司；HH-4数显恒温水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司；CHI 660D电化学工作站，上海辰华仪器有限公司；Forcipol 2V研磨抛光机，英国科密特公司；HF90 CO2培养箱，力新仪器（上海）有限公司；Leica DMi8倒置相差显微镜，德国徕卡公司；MK3酶标仪，美国赛默飞世尔公司；PHS-3C精密酸度计，上海大普仪器有限公司。

无水乙醇，99.5%，天津市风船试剂科技化工有限公司；冰乙酸，99.5%，天津市津北精细化工有限公司；模拟体液（SBF），东莞市创峰自动化科技有限公司；人脐静脉内皮细胞（HUVEC），中国科学院细胞库；1640细胞培养液、磷酸盐缓冲液（PBS），江苏凯基生物技术股份有限公司；胎牛血清（FBS），美国GeminiBio公司；CCK-8检测试剂盒，日本Dojindo公司。

1.3 合金浸提液的制备

锻造态Mg-Zn-Zr/-Y镁合金样品（直径20 mm，厚度3 mm）使用无水乙醇超声清洗，用去离子水快速冲洗烘干，紫外灯辐照灭菌，正反面各照射30 min，然后放于无菌离心管中，保存在无菌箱中待用。以1640细胞培养液为浸提介质，按试样表面积（cm2）与浸提介质体积（mL）之比为1.25∶1.00的比例加入1640细胞培养液，并置于37 ℃恒温、95%相对湿度和5%的CO2培养箱内24 h，得到合金浸提液原液[11-12]。然后加入1640培养基，以单纯1640培养基为阴性对照组，以含有0.64%苯酚作为阳性对照组。合金材料均经过121 ℃高温高压灭菌。

1.4 细胞的传代培养

HUVEC接种于含10%的FBS、100 U/mL青霉素和100 g/mL链霉素的1640培养基，在37 ℃恒温、95%相对湿度和5%的CO2培养箱中培养，每3 d更换1次溶液。当细胞生长成单层汇合至80%时进行细胞传代培养。

将培养基倒掉，加2 mL的PBS冲洗一下，加1～2 mL的0.25% EDTA-胰酶（室温），镜检细胞形态，待细胞变形后去除胰酶，加入含有FBS的完全培养基终止消化。吸管轻柔吹打，尽量让细胞均匀分散，后取出培养基在1 000 r/min离心5 min；去掉上清液，加入3 mL完全培养基后重置，接种到3个培养皿中，放到37 ℃恒温CO2培养箱中培养。

1.5 CCK-8法细胞毒性测试

细胞悬液处理细胞24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8试剂，混匀后在培养箱中孵育1 h，测定450 nm波长处的吸光值。细胞的相对增殖率（RGR）通过式（1）计算：

式中，ODT1为实验组材料的平均吸光度值，ODN1为阴性对照组（培养液+CCK-8）的平均吸光度值。

根据ISO 10993-5：1999[11]标准要求，细胞增殖率和细胞毒性的相对关系见表2。其中，0级和1级表示没有细胞毒性，2级表示轻度细胞毒性，3级表示中度细胞毒性，4级表示明显细胞毒性。

表2 细胞增殖率与细胞毒性分级的对应关系

1.6 细胞形态观察

将细胞悬液接种于96孔培养板中（5 000个/孔），37 ℃、5%的CO2培养箱培养，加细胞悬液之前细胞拍照记录。分别于第1 d、4 d和7 d在倒置相差显微镜下观察细胞形态，拍照记录。

1.7 体外溶血率测试

（1）浸提液的制备

所有样品均使用无水乙醇超声清洗，用去离子水快速冲洗烘干，紫外灯辐照灭菌，正反面各照30 min，放于无菌离心管中，保存在无菌箱中待用。按照ISO标准制备浸提液[13]：将2种试验样品（锻造态Mg-Zn-Zr/-Y合金）按照样品表面积（cm2）∶溶液体积（mL）为1.25∶1的比例分别浸泡于50 mL生理盐水中，于（37±0.5）℃无菌培养箱中培养24 h。

（2）体外溶血试验

分实验组、阴性对照组和阳性对照组，基础溶液分别为浸提液、生理盐水及蒸馏水。3组分别加入200 μL样品至0.6 mL的小试管中，37 ℃恒温水浴30 min。10 mL生理盐水与8 mL人抗凝血（含0.5 mL浓度为20 g/L的草酸钾）混合，之后分别取200 μL加入各试管，37 ℃水浴 60 min，1 500 r/min离心 5 min，上清液在分光光度计545 nm波长处测定吸光度，每组3个平行样本，计算平均值。根据公式（2）计算溶血率（HR）：

其中，ODT2、ODN2和ODP2分别代表实验组、阴性对照组（生理盐水）和阳性对照组（蒸馏水）吸光度值，溶血率小于5%表示材料无明显溶血。

1.8 统计分析

本实验数据采用SPSS 13.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），两组间均数比较采用t检验，P＜0.05认为有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 材料对模拟体液pH值的影响

图1为纯镁及锻造态Mg-Zn-Zr和Mg-Zn-Zr-Y镁合金在（37±0.5）℃恒温SBF中浸泡240 h的pH值变化曲线。从图1中可以看到，在浸泡腐蚀的初期，所有样品的pH值上升都较快，浸泡48 h后pH值上升到最高点，都在10以上。发生此种现象的主要原因是镁合金在浸泡腐蚀过程中，其表面会发生化学反应并析出大量的H2，阴极溶解会生成OH-，在模拟体液体积保持不变的情况下，体系中的OH-含量必然会越来越多，随着浸泡腐蚀的不断进行，模拟体液不断地被碱化，镁合金腐蚀也越严重。这个碱化特性也决定了镁合金在实际体液环境中表面总是更易于碱化。

图1 纯镁及锻造态Mg-Zn-Zr/-Y合金对SBF体系pH值变化的影响

从图1可以看出碱化效应最终使得体系pH值稳定在9.5左右。但是应当注意的是，当合金植入生物体内时，由于生物体内体液环境是动态交换循环的，所以体内pH值的升高将会刺激生物体内的酸碱平衡系统进行自我调节，因此并不会像体外模拟实验一样升高到9.5。

2.2 合金材料的溶血特性

由表3可知，锻造态Mg-Zn-Zr合金溶血率为0.6%，锻造态Mg-Zn-Zr-Y合金溶血率为0.5%，均低于5%，表明锻造态Mg-Zn-Zr和Mg-Zn-Zr-Y镁合金不会导致严重溶血现象发生。根据ISO标准[12]，锻造态Mg-Zn-Zr和Mg-Zn-Zr-Y镁合金在体外降解过程中对红细胞无明显的破坏作用，具有优良的血液相容性。

表3 Mg-Zn-Zr/-Y镁合金溶血实验结果（n=3）

2.3 合金材料的体外生物相容性

2.3.1 锻造态Mg-Zn-Zr和Mg-Zn-Zr-Y镁合金的细胞毒性

CCK-8法研究合金材料的细胞毒性实验结果见表4。从表4可知，细胞在锻造态Mg-Zn-Zr（合金A）和Mg-Zn-Zr-Y（合金B）镁合金材料不同浓度浸提液中分别培养1 d、4 d 和7 d后，在同一时间节点，细胞的活性（OD值）与阴性对照组相比具有显著性差异（P＜0.05）；细胞在同一浓度浸提液中培养不同时间的细胞活性之间差异显著（P＜0.05）。

表4 不同组别吸光度(OD)及细胞相对增殖率(RGR)结果（n=3）

培养7 d后，当浸提液浓度为10%时，细胞的相对增殖率均大于90%，细胞毒性为0～1级；当浸提液浓度为50%时，细胞的相对增殖率为15.1%～38.2%，细胞毒性为3～4级，呈中度和明显细胞毒性；当浸提液浓度为100%时，细胞的相对增殖率为13.6%～14.9%，细胞毒性为4级，呈明显细胞毒性。

CCK-8实验结果表明锻造态Mg-Zn-Zr和Mg-Zn-Zr-Y镁合金材料的浸提液浓度为10%时，对细胞的毒性较小，几乎不影响细胞的增殖；而当浸提液的浓度为50%或100%时，对细胞有毒性作用，且会影响细胞的增殖。

2.3.2 锻造态Mg-Zn-Zr和Mg-Zn-Zr-Y合金对细胞形态的影响

图2为HUVEC在不同浓度（100%、50%、10%）锻造态Mg-Zn-Zr合金浸提液和对照组中培养1 d、4 d和7 d后在倒置相差显微镜下观察到的细胞形态。图3为HUVEC在不同浓度（100%、50%、10%）锻造态Mg-Zn-Zr-Y合金浸提液和对照组中培养1 d、4 d、7 d后在倒置相差显微镜下观察到的细胞形态。

图2 不同浓度Mg-Zn-Zr浸提液对HUVEC细胞形貌的影响（10×）

图3 不同浓度Mg-Zn-Zr-Y合金浸提液对HUVEC细胞形貌的影响（10×）

从图2和图3可以看出，培养第1 d，细胞密度低，50%Mg-Zn-Zr浸提液和100%、50%Mg-Zn-Zr-Y浸提液培养的细胞出现死亡现象，其他浓度浸提液培养的细胞几乎全部贴附在培养板的底部，细胞呈现扁平梭形，轮廓清晰；培养第4 d，细胞增殖迅速，形态正常；培养第7 d，100%和50%Mg-Zn-Zr-Y浸提液培养的细胞出现死亡现象，10%浓度浸提液培养的细胞数量显著增加，成团簇增长。然而，在同一时间节点不同组的细胞形态与阴性对照组无明显差异。

3 结论

本文研究了锻造态Mg-Zn-Zr和Mg-Zn-Zr-Y镁合金对模拟体液pH值及其浸提液对HUVEC细胞的影响，发现锻造态Mg-Zn-Zr/-Y镁合金在模拟体液中的腐蚀速度均高于纯镁的腐蚀速度；锻造态Mg-Zn-Zr/-Y合金不会导致严重溶血，体外降解过程中对红细胞无明显的破坏作用，具有优良的血液相容性；锻造态Mg-Zn-Zr/-Y镁合金材料的浸提液浓度为10%时，几乎不影响细胞增殖，而当浸提液的浓度为50%或100%时，对细胞有一定的毒性作用，会影响细胞增殖；在100%和50%Mg-Zn-Zr-Y浸提液培养7 d后，HUVEC出现死亡，10%浓度浸提液培养的细胞数量则显著增加，成团簇增长。