乳铁蛋白活性六肽(LfcinB 4-9)增加人宫颈癌细胞对顺铂的敏感性及其机制

刘 芸，徐 恰，刘力伟，戚 楠，秦宜德，

作者单位：安徽医科大学基础医学院1生物化学与分子生物学教研室、2免疫教研室，合肥 230032

宫颈癌是全世界妇女最常见的癌症之一[1]，其存活率低，预后不佳[2]。化疗和放疗常见的是宫颈癌治疗方案。顺铂是常用的化疗药物，目前针对该药物的主要研究目标是不断提高药效以降低该药物的副作用及降低机体产生的耐药[3]。p62是一种自噬受体，近期被证明[4]可以将泛素化蛋白质递送到蛋白酶体进行降解。p62增加会延迟泛素化蛋白向泛素蛋白酶体系统的降解，而p62缺失会加剧细胞损伤。乳铁蛋白活性源六肽(LfcinB 4-9)来自于牛乳铁蛋白的乳铁蛋白抗菌肽(bovine lactoferricin，LfcinB)，是其活性中心，序列为RRWQWR，其中3个Arg残基(带有正电荷)通过肿瘤细胞外膜负电荷吸引而结合，通过翻转扩散(flip-flop)进入胞内。该文主要研究LfcinB 4-9增加药物敏感性的作用，探索LfcinB 4-9与DDP联合作用在宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移中发挥的作用，以期为宫颈癌治疗提供潜在的治疗方法。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂本实验使用的Hela细胞、p62 KO Hela细胞由许尹教授(美国贝勒医学院)馈赠。LfcinB 4-9由上海生工公司合成; 顺铂购自云南植物药业有限公司；MTT购自美国Promega公司；TRIzol购自美国Thermo Fisher公司；逆转录试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；PCR引物由上海生工合成；PCR MIX购自美国Promega；胎牛血清购自杭州四季青公司； Annexin V/PI双染凋亡试剂盒购自上海贝博公司。β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记抗鼠IgG、辣根过氧化物酶标记抗兔IgG购自北京中杉金桥有限公司；SIAH抗体购自爱博泰克生物技术公司；PSMA、β-catenin抗体购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 人宫颈癌细胞Hela和Hela/KO p62使用含有10% FBS、1%青霉素-链霉素的DMEM培养，并置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。

1.2.2细胞增殖实验 分别取对数生长期的HeLa细胞和p62 KO HeLa细胞以5.0×103/孔的密度接种到96孔板中，用不同浓度的 LfcinB 4-9(0.15、1.5、15 μmol/L)和 DDP(IC50)刺激24、48和72 h后，每孔加入20 μl MTT置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育4 h。 弃去上清液，每孔加200 μl DMSO。用酶标仪(Bio-Rad)在490 nm波长处测量吸光度(optical density, OD)值，以空白为对照，按照计算公式细胞存活率(%) ，计算公式如下如下：抑制率(Ⅰ)(%)=1-(OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)，计算化疗药物的抑制率和半抑制浓度(IC50)并建立细胞生长抑制曲线。

1.2.3流式细胞仪检测细胞凋亡 将1×106个细胞接种于6孔板中培养过夜。分为6组加药：正常对照组、15 μmol/L LfcinB 4-9组、 DDP(IC50)组、DDP(IC50)+0.15 μmol/L LfcinB 4-9组、DDP(IC50)+1.5 μmol/L LfcinB 4-9组、DDP(IC50)+15 μmol/L LfcinB 4-9组。作用48 h后，用不含EDTA的胰酶消化后收集细胞，用冷PBS洗涤细胞2次。将细胞重悬于400 μl 1×Annexin结合液中，在细胞悬液中加入5 μl膜联蛋白 V-异硫氰酸荧光素(FITC)，轻轻摇匀后于4°C避光条件下孵育15 min，加入10 μl PI染色液后轻轻混匀并于4 ℃避光条件下孵育5 min。在2 h内用流式细胞仪检测，并用FlowJo7.6.1软件分析实验结果。

1.2.4平板克隆检测细胞克隆形成 将Hela细胞(1×103) 和Hela/KO p62细胞(1×103)分别接种在6孔板中，按照上述分组加药，每2 d更换1次新鲜培养基，在完全培养基中培养2周。 弃去培养基，用4%多聚甲醛固定细胞并用0.1%结晶紫染色30 min。 拍摄图像，并计算每个孔中的克隆数。细胞克隆抑制率(%)=1-(加药组形成的克隆数/空白对照组形成的克隆数)。

1.2.5RT-qPCR检测E3泛素连接酶(seven in absentia homologue，SIAH)、蛋白酶体(蛋白酶体，巨蛋白因子)亚基-α型[proteasome(prosome-macropain) subunit alpha type，PSMA]、β-连环蛋白(β-catenin)的mRNA表达情况 通过RT-qPCR定量检测相关基因表达的mRNA。使用 TRIzol 试剂从宫颈癌细胞中提取总 RNA。使用逆转录试剂盒将RNA 逆转录为互补 DNA(cDNA)。 按照试剂盒说明配置10 μl体系后上机。使用 qPCR 测定法(SYBR Green；Bio-Rad，USA)测定蛋白 mRNA 的表达； β-actin用作内部对照。qPCR条件如下：预变异95 ℃ 1 min，扩增95 ℃、20 s，56 ℃、30 s，72 ℃、30 s，40个循环，溶解95 ℃、10 s，65 ℃、60 s，97 ℃、1 s，冷却37 ℃、30 s。使用2-ΔΔCt方法计算相对mRNA表达。见表1。

1.2.6Western blot检测SIAH、PSMA、β-catenin的蛋白的表达情况 将宫颈癌细胞分为6组加药：对照组、1.5 μmol/L LfcinB 4-9组、DDP(IC50)组、DDP(IC50)+0.15 μmol/L LfcinB 4-9组、DDP(IC50)+1.5 μmol/L LfcinB 4-9组、DDP(IC50)+15 μmol/L LfcinB 4-9组。培养48 h后收集细胞总蛋白，经电泳、电转、孵育一抗、二抗，洗涤后显影并用Image J进行灰度值分析。

2 结果

2.1 对Hela/KO p62内p62蛋白表达的检测通过Western blot检测敲除株p62蛋白的表达，结果表明敲除株内p62蛋白不表达，差异有统计学意义(P<0.01)。见图1。

图1 Western blot检测敲除株p62蛋白表达

2.2 联合用药对宫颈癌细胞的增殖的影响为了研究 LfcinB 4-9与DDP联合用药对宫颈癌细胞的影响，Hela和p62 KO Hela细胞系用不同浓度的LfcinB 4-9和相同浓度的DDP处理 24～72 h，并评估细胞增殖。结果显示单独用LfcinB 4-9细胞生长抑制率较小，当DDP和LfcinB 4-9联合作用时，细胞的生长抑制率增高，并且随着LfcinB 4-9的度的增高而逐渐增高，差异有统计学意义(F=56.72,P<0.01；24 h：21.3±1.06；48 h：28.5±1.13；72 h：30.5±0.98)。见图2。

2.3 联合用药对宫颈癌细胞克隆形成的影响通过克隆形成实验观察联合用药对宫颈癌细胞增殖的抑制。结果表明，与对照组相比，加药组细胞克隆形成显著降低，并且LfcinB 4-9与DDP联合作用效果更强，克隆形成能力随着Lfcin B 4-9的浓度的增加而逐渐降低。与Hela对比，p62敲除抑制了宫颈癌细胞的增殖，集落数少于HeLa组，差异有统计学意义(F=72.5,P<0.01)。见图3。

2.4 联合用药对宫颈癌细胞凋亡的影响为了研究 LfcinB 4-9 是否可以调节 Hela和p62 KO Hela 细胞对 DDP 的抗性，分别用不同浓度的LfcinB 4-9和相同浓度的DDP作用于这两种细胞。 流式细胞术结果显示，与对照组对比，加药组的凋亡率增加。单独用LfcinB 4-9或者DDP，细胞凋亡率略有增加。当联合用药时，细胞凋亡率增加，并且细胞凋亡率随着LfcinB 4-9浓度的增高而逐渐增高，差异有统计学意义(F=120.5，P<0.01)。与Hela组对比，联合用药对Hela/KO p62组促进细胞凋亡作用更强。这些结果表明联合用药促进宫颈癌细胞的凋亡，LfcinB 4-9可以通过促进体外 DDP 诱导的细胞凋亡调节宫颈癌细胞对 DDP的抵抗力。见图4。

2.5 LfcinB 4-9联合DDP处理对人宫颈癌细胞的PSMA、SIAH、β-catenin基因表达的影响qRT-PCR结果显示,与对照组相比，单独用LfcinB 4-9处理的Hela和Hela/KO p62细胞中PSMA、SIAH、β-catenin表达水平无明显变化。与LfcinB 4-9组相比，联合用药组的PSMA、SIAH基因表达量增加，且随着LfcinB 4-9浓度的增加表达水平逐渐增加，而联合用药组β-catenin的表达水平降低，随着LfcinB 4-9浓度的增加表达水平有不同程度的降低，差异有统计学意义(P<0.01)。与Hela细胞相比，相同加药组Hela/KO p62细胞中PSMA、SIAH表达水平有不同程度的下降，β-catenin表达水平变化差异无统计学意义。见图5。

2.6 LfcinB 4-9联合DDP处理对人宫颈癌细胞的PSMA、SIAH、β-catenin蛋白表达的影响用LfcinB 4-9(1.5 μmol/L)、DDP(48 h IC50)、DDP(48 h IC50)+LfcinB 4-9(0.15 μmol/L)、DDP(48 h IC50)+LfcinB 4-9(1.5 μmol/L)、DDP(48 h IC50)+ LfcinB 4-9(15 μmol/L)共5种不同浓度药物作用于Hela和Hela/KO p62 48 h后， Western blot结果显示，单独用LfcinB 4-9组SIAH、PSMA、β-catenin蛋白表达水平无明显变化， 联合用药时，SIAH、PSMA蛋白表达量上升，随着联合作用时用LfcinB 4-9浓度的增高，表达量有不同程度的上升。与对照组相比，联合用药时随着药物浓度的增加，β-catenin的蛋白表达量有不同程度的下降，差异有统计学意义(P<0.01)。联合用药和单独DDP组相比，随着LfcinB 4-9浓度的増高，SIAH、PSMA蛋白表达水平有不同程度的上升，β-catenin蛋白表达水平有不同程度的下降，差异有统计学意义(P<0.01)。见图6。

图2 MTT检测联合用药对2种细胞增殖能力的影响

图3 平板克隆实验检测联合用药对人宫颈癌细胞细胞克隆形成能力的影响

图4 不同浓度药物对Hela、Hela/KO p62凋亡的影响

图5 不同浓度药物对Hela、Hela/KO p62细胞相关基因mRNA的影响

图6 Western blot检测各组SIAH、PSMA、β-catenin蛋白表达

3 讨论

宫颈癌是妇科可致死的恶性肿瘤，DDP已被用作治疗这种癌症最有效的放化疗药物之一。然而，现已在宫颈癌细胞中发现了治疗耐药性，尤其是在转移性、复发性和晚期疾病的患者中[5]。由于顺铂的耐药性，许多天然产物被用于研究抗癌药物的开发[6]。源自牛、山羊、绵羊、水牛和骆驼奶的乳源活性肽肽具有多功能特性，包括免疫调节、抗氧化、酶抑制作用、抗血栓形成和对抗各种毒物的拮抗活性。其中大部分调节免疫、胃肠道、激素和神经反应，从而在预防癌症、骨质疏松症、高血压和其他疾病方面发挥重要作用[7]。LfcinB 4-9是一种来自牛乳铁蛋白的生物活性肽，安全无毒。

泛素-蛋白酶体途径 (UPP) 影响细胞功能，包括细胞生长、分化、凋亡、信号转导、抗原加工和炎症反应，现在已被认为是细胞蛋白质降解最重要的方法之一。蛋白酶体控制蛋白质降解的执行并在泛素-蛋白酶体途径中发挥关键作用。蛋白酶体与癌症之间密切联系的展开为使用蛋白酶体抑制剂治疗癌症提供了潜在的策略[8]。抑制蛋白酶体系统可能代表一种治疗和克服耐药性恶性肿瘤耐药性的新策略。泛素-蛋白酶体系统 (UPS) 和自噬是两个不同且相互作用的蛋白水解系统。它们在正常条件下和压力下的细胞存活中起着关键作用。p62 是一种经典的自噬受体，是一种多功能蛋白质，位于整个细胞中，参与许多信号转导通路。它参与泛素化蛋白质的蛋白酶体降解。当细胞 p62 水平波动时，泛素化蛋白质的数量和位置也会发生变化，对细胞存活产生相当大的影响。抑制蛋白酶体所导致的应激可以通过 p62 磷酸化激活自噬。自噬缺陷可能会损害泛素-蛋白酶体系统，因为尽管蛋白酶体催化活性没有改变，但过多的 p62 会延迟蛋白酶体底物向蛋白酶体的递送[8]。

β-catenin是一种多功能蛋白质，在生理稳态中起核心作用[9]。β-catenin的高水平细胞质表达和核定位总是诱导致瘤性状并促进癌细胞增殖和存活。此外，它还可以通过抑制T细胞反应促进肿瘤的进展[10]。β-连环蛋白的稳定在肿瘤发生中至关重要，这通常是由异常 Wnt 激活和β-连环蛋白的体细胞基因突变或破坏复合物组分诱导的[11]。β-catenin的泛素化是一个复杂的过程，磷酸化的β-catenin 被特定的E3泛素连接酶识别和泛素化，并在蛋白酶体中降解。相应的E3泛素连接酶在不同的亚细胞位置是不同的。在细胞质中，β-TrCP、Jade1、SIAH是介导 β-连环蛋白泛素化的E3连接酶[12]。除了Jade1、SIAH也诱导非磷酸化 β-catenin 泛素化，以响应肿瘤抑制因子 p53 以促进 β-catenin 降解[9]。

本研究探究LfcinB 4-9与DDP联合作用对宫颈癌细胞增殖与迁移的影响，显示联合用药可以提高DDP在宫颈癌Hela和Hela/KO p62细胞中的药物作用，且细胞凋亡率比单独用LfcinB 4-9或DDP增长显著。在控制DDP浓度相同的条件下，细胞凋亡率随着LfcinB 4-9浓度的增加逐渐升高。同时，LfcinB与DDP联合用药抑制宫颈癌细胞的增殖和克隆形成。通过干扰p62基因表达，宫颈癌细胞耐药性降低。此外，本研究还表明，联合用药使SIAH、PSMA1的表达量增加，而β-catenin的表达量降低，这表明LfcinB 4-9可能通过蛋白酶体途径抑制宫颈癌的耐药性，为宫颈癌治疗提供了一种新的思路。