基于网络药理学和实验验证探讨何首乌对阿尔茨海默病的作用机制*

池鑫宇，杨 柯，曾春晖

（广西中医药大学，南宁 530200）

随着我国第七次人口普查数据的公布[1]，人口年龄结构变化及社会老龄化进一步加深等问题再一次受到全社会热议，其中老年疾病包括神经退行性疾病，高血糖、高血压、高血脂，肿瘤等尤其需要引起重视。以认知功能障碍记忆缺失为外在特征的阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD），在国际上已成为继肿瘤、心血管疾病之后居第3 位的致死性疾病[2]。全球65 岁以下患病率约为4%，75 岁以上患病率骤升至40%左右，AD 的高发病率和较高的死亡率使其成为全球公共健康问题之一[3]。

何首乌，蓼科多年生草本植物何首乌（Polygonum multiflorum Thunb.）的干燥块根。何首乌中主要含有二苯乙烯苷类，蒽醌类，多糖类，卵磷脂等有效活性成分。在何首乌药理作用方面，学者们的研究集中于抗氧化，免疫调节，神经保护，抗衰老，降血脂等方面，其在中医临床治疗AD 中的使用频率较高，同时学者们发现何首乌炮制后药理作用效果出现差异[4]。

网络药理学是近年来快速发展起来的一门综合系统生物学、生物信息学、计算机科学等学科的新兴学科[5]。中医通过整体的方法治疗疾病，其所使用的中药在分子层面呈现多成分，多靶点特征与网络药理学研究药物作用机制的核心思想异途同归。为研究何首乌改善AD的作用机制和不同何首乌成分的作用差异，通过文献资源整合和网络药理学方法将何首乌中有效成分作用靶点与AD发病机制相关联，匹配找出何首乌作用于AD 的靶点和通路，同时在实验中加以验证并探讨不同蒸晒程度何首乌的作用差异。

1 材料和方法

1.1 动物、细胞和主要试剂

30 只SD 大鼠（180～200 g，雌雄各半），由湖南斯莱克景达实验动物公司（实验动物生产许可证：SCXK 2019-0004）提供；30 只APP/PS1 双转基因小鼠[16 周龄，（27±2）g，雄性]和5 只野生型C57BL/6小鼠[16周龄，（25±2）g，雄性]由常州卡文斯实验动物公司提供（实验动物生产许可证：SCXK 2016-0010）。大小鼠分不同房间饲养在SPF 级动物房设施内，温度（24±3）°C，湿度（70±15）%，光/暗交替周期为12 h，不受限制地获得食物和水，实验开始前适应性饲养5 d。成年大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞系PC12 细胞由广西中医药大学夏星教授惠赠，ATCC细胞数据库编号：CRL-1721。

何首乌生品饮片购买于何首乌地道产区中国广东德庆药材批发市场，经广西中医药大学郭敏副教授鉴定为蓼科植物何首乌（Polygonum multiflorum Thunb.）的干燥块根。白细胞介素1β（IL-1β，ERC007.96）、肿瘤坏死因子α（TNF-α，ERC102a.48）和白细胞介素6（IL-6，ERC003.96）的ELISA试剂盒购买自欣博盛生物公司，Fluo-3AM 荧光探针购买自碧云天生物公司。IL-1β（16806-1-AP）、TNF-α（17590-1-AP）蛋白抗体购买自Proteintech 生物公司，IL-6（bs-6309R）蛋白抗体购买自博奥森公司。

1.2 文献资源整合

通过检索全球文献数据库，收集了近10年来与AD发病机制、何首乌药理作用相关的文献，提取其中的关键句段进行整合。探讨AD发病机制与何首乌药理作用之间的潜在关联，并绘制关联图。

1.3 何首乌潜在作用AD的蛋白靶点收集

本研究通过挖掘中医药整合药理学研究平台数据库（integrative pharmacology-based research platform of traditional Chinese Medicine，TCMIP，http://www.tcmip.cn）[6]，收集何首乌中主要有效成分，利用Pubchem（www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）进行确证，运用Pharmmapper（www.lilab-ecust.cn/pharmmapper）预测靶点，筛选可信度≥0.800的蛋白靶点并整合草药成分目标平台（herbal ingredients'targets platform，HIT）数据库中何首乌蛋白靶点。在GeneCards（http://www.genecards.org）与DisGeNet数据库（https://www.disgenet.org/）中检索AD相关疾病基因。绘制韦恩图将获得的疾病靶点与获得的何首乌靶点取交集，即得到何首乌改善AD 的潜在作用靶点。

1.4 蛋白质互作网络（PPI）构建与关键作用靶点筛选

将上述得到的潜在作用靶点导入STRING（www.string-db.org）网站数据库中[7]，设置筛选参数，选择物种为“homo sapiens”，将交互得分最高置信度设置为≥0.7，隐藏游离靶点，其余参数保持默认设置，得到靶蛋白之间的PPI网络。将PPI网络相互作用信息导入Cytoscape 3.9.1 软件中[8]，使用MCODE 插件设置参数，Degree Cutoff：2.0、Node Score Cutoff：0.2、K-core：2.0、Max.Depth：100.0，筛选出核心关键靶点网络。

1.5 蛋白靶点通路富集分析

基于上述筛选得到的核心关键靶点，使用R 语言，载入ggplot2、clusterProfiler、AnnotationHub、org.Hs.eg.db等程序包对何首乌作用AD的靶点进行GO功能富集分析和KEGG 通路富集分析[9]，并对富集分析的结果进行可视化。

1.6 何首乌“九蒸九晒”法炮制与药物制备

本实验依照传统黑豆汁制“九蒸九晒”炮制方法对何首乌进行炮制[10-11]。称取10 kg 黑豆，加8 倍量水，煎煮4 h，浓缩熬汁约15 kg，黑豆渣再加水煮3 h，熬汁10 kg，合并得黑豆汁约25 kg。用制备好的黑豆汁将100 kg何首乌生品饮片浸润1 h，后放入常压蒸箱96 ℃蒸制4 h，取出，摊平置于日光下曝晒6 h，大约至七成干，如此重复9次，依次分别制备得到“一蒸一晒”制何首乌（Process-1，P1），“二蒸二晒”制何首乌（Process-2，P2）至“九蒸九晒”制何首乌（Process-9，P9）9 个程度的炮制品与何首乌生品（Raw-0，R0），均按比例留样备用。

取何首乌R0，P3，P6与P9四种药材各10 kg，加入8倍量水，浸润1 h，煮制1.5 h过滤药液，何首乌药渣再加入8倍量水煎煮1.5 h，合并药液，减压浓缩至约1.5 g（生药）/g的流浸膏状态，称重准确计算生药重量与流浸膏重量比值，低温保存待用。取SD 大鼠以体重为依据进行随机区组化分组分为5 组，6 只/组，雌雄各半，分别灌胃制备的何首乌R0，P3，P6，P9不同炮制程度何首乌流浸膏生理盐水稀释药液，20 g（生药）/kg，20 mL/kg，2次/d，8:00 am与8:00 pm各1次，连续5 d，另有一组大鼠灌胃相同容积生理盐水为空白血清组。末次灌胃1.5 h 后，麻醉，腹主动脉采血，离心分离上层血清。56 ℃水浴灭活血清30 min。同组雌雄大鼠血清混匀后过0.22 nm 滤膜除菌，-20 ℃保存待用[12]。

1.7 筛选含药血清干预浓度

在PC12 细胞达到对数生长期时，消化细胞，以3×105/mL，100 μL/孔将细胞接种于96 孔板内，培育24 h待其贴壁后，分组。换液给药，100 μL/孔，对照组给予含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）培养基，空白组给予含10%空白小鼠血清培养基，何首乌含药血清组给予R0，P3，P6，P9 四种炮制程度何首乌的10%（10%含药血清+0%空白血清），5%（5%含药血清+5%空白血清），1%（1%含药血清+9%空白血清）含药血清，孵育24 h。MTT 法检测不同炮制品含药血清对细胞增殖的影响，以此来筛选合适的含药血清干预浓度。

1.8 含药血清对于模型细胞增殖的影响

在PC12 细胞达到对数生长期时，将细胞以3×105/mL，100 μL/孔接种于96 孔板，培育24 h 待其贴壁后，分为空白组、模型组、R0 组、P3 组、P6 组和P9组，将空白组、模型组换为含10%空白大鼠血清培养基，何首乌组换为对应炮制程度的含药血清培养基，孵育18 h，之后将空白组细胞上清换为无血清DMEM培养基，其余组换为含10 mg/L脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的无血清DMEM 培养基，孵育造模18 h。而后使用MTT 法检测各组的细胞活力水平。

1.9 含药血清对细胞因子水平和细胞状态的影响

细胞种板分组和含药血清干预步骤与“1.8 项”相同。吸取上层细胞培养基，离心取上清，按对应ELISA细胞因子试剂盒说明书检测培养基中IL-1β、IL-6和TNF-α细胞因子的活力水平。

通过Fluo-3 am探针标记细胞Ca2+，以荧光度值来评估细胞活力[13]。将对数生长期PC12 细胞以3×105/mL，1 mL/孔接种于35 mm 培养皿中，培育24 h待其贴壁，后续LPS干预方法同上述实验。吸弃去细胞上清，滴加入2 mL PBS 缓冲液吹打润洗2 次，加入2.5 μM/L Fluo-3 am 探针对细胞内Ca2+离子进行染色标记。使用倒置荧光显微镜，488 nm波长激发荧光，观察细胞荧光强度和细胞形态。

1.10 动物给药及蛋白表达水平检测

5 只野生型C57BL/6 设为正常对照组，将APP/PS1小鼠随机分为6组，模型组灌胃生理盐水，阳性组灌胃给药0.02 mg/kg石杉碱甲药液，R0组、P3组、P6 组、P9 组分别灌胃不同炮制程度何首乌水煎液，10 g（生药）/kg，灌胃容积：20 mL/kg，1 次/d，连续180 d。

180 d实验终点处死APP/PS1小鼠，经心脏灌流4℃生理盐水，取脑。切取含海马部分的脑组织，采用蛋白免疫印迹法（Western Blotting，WB）对小鼠脑组织中IL-1β、TNF-α、IL-6 蛋白相对表达水平进行检测。使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，稀释调节蛋白浓度，使后续电泳上样体积为5 μL，蛋白量为30 μg。使用配制10%电泳凝胶，上样，电泳，转膜，封闭。依据预染蛋白marker所标记的不同分子量位置，将PVDF 膜据实验中目的蛋白的前期实验中摸索的分子量位点切割为条带。一抗稀释液稀释抗体，IL-1β，TNF-α，IL-6 和β-actin 的稀释比例为1∶1 000。摇床4℃孵育过夜，洗膜，加入二抗室温孵育2 h，洗膜。将ECL显影液反应显影，化学发光成像系统曝光拍摄条带图像。使用Image Lab软件处理分析图像，计算灰度值与相对蛋白表达水平。

2 结果

2.1 AD发病机制与何首乌药理作用的关联

AD发病机制复杂，多种发病假说相互关联，研究分析整合了五种流行的致病假设的研究（表1）；同时研究也整合了何首乌的药理作用（表2）。何首乌药理作用与AD发病机制的关联如图1绘制所示。

表1 AD发病机制文献整合表

表2 何首乌药理作用文献整合表

图1 何首乌药理作用与AD发病机制的关联网络图

2.2 何首乌作用AD的蛋白靶点

通过TCMIP平台检索到何首乌18个主要有效化合物，通过Pharmmapper 预测得到何首乌可信度≥0.800 的靶点共361 个，在HIT 数据库中筛选得到262 个靶点，二者整合去重复后得到何首乌作用靶点413 个。GeneCards 数据库检索得到AD 相关靶点3 397个，DisGeNet数据库检索得到AD相关靶点1 749个。何首乌与疾病集合共有靶点为181个，见图2。构建PPI并通过Cytoscape 的MCODE 插件筛选出核心靶点共88个（图3），度值前20靶点，见表3。

表3 何首乌改善AD的关键靶点

图2 药物与疾病靶点的交集靶点

图3 PPI网络与关键靶点的筛选

2.3 何首乌改善AD靶点的GO/KEGG富集分析

GO富集结果包括3个模块，分别为生物学过程（BP）、细胞组成（CC）和分子功能（MF）。BP主要涉及细胞对化学应激的反应，对氧化应激的反应，对脂多糖的反应，细胞对氧化应激的反应，对细菌来源分子的反应等（图4）。在KEGG 通路富集分析中，何首乌改善AD主要富集在AGE-RAGE信号通路，脂质和动脉粥样硬化，流体剪切应力和动脉粥样硬化，HIF-1，PI3K-Akt，TNF 等信号通路上（图5）。

图4 何首乌改善AD靶点GO富集分析

图5 何首乌改善AD靶点KEGG富集分析

2.5 何首乌含药血清对正常细胞活力的影响

含药血清干预浓度筛选实验结果如图6A 所示，结果表明在10%含药血清浓度的干预下，细胞活力没有表现出显著变化差异，5%浓度时P3 显著高于P6 组，1%浓度干预的P9 组细胞活力相较其他组有升高的趋势。基于上述结果，在后续实验中将采用10%含药血清作为干预浓度，在该浓度时R0组，P3 组，P6 组和P9 组细胞活力无显著差异，且与细胞常规培养时使用的胎牛血清浓度相同，同时可提供较大的药物剂量。

2.6 何首乌含药血清对模型细胞的干预作用

MTT 法检测结果表明（图6B），模型组的细胞活力低于对照组（P＜0.01），页R0 组（P＜0.01），P3 组（P＜0.05），P6 组（P＜0.000 1）和P9 组（P＜0.000 1）细胞活力水平均显著高于模型组，且细胞活力有随着炮制程度加深而增加的趋势，P9组细胞活力显著高于R0组（P＜0.05）。

2.7 荧光探针标记的细胞状态

Flu-3AM 探针标记的荧光激发拍摄图像如图6C 所示，在相同曝光增益参数条件下，观察到对照组细胞荧光度值较高，细胞突触正常，而模型组细胞整体荧光度值较暗，仅可见个别细胞在细胞核处较亮，细胞突触长度变短，R0 组细胞形态较模型组有一定转好，P3组，P6组与P9组细胞整体荧光度值高，细胞突触较正常，细胞状态转好。

图6 不同蒸晒程度何首乌含药血清对细胞的干预作用

2.8 何首乌含药血清对细胞因子水平的影响

细胞上清液所测定的细胞炎症因子水平检测结果显示（图7），模型组IL-1β水平显著高于空白组（P＜0.01），而R0 组（P＜0.05），P3 组（P＜0.000 1），P6 组（P＜0.001）和P9 组（P＜0.05）IL-1β 水平显著低于模型组；模型组TNF-α 水平显著高于空白组（P＜0.000 1），而R0 组，P3 组和P6 组TNF-α 水平有降低的趋势，其中P6显著低于模型组（P＜0.05）；与对照组比较，模型组IL-6 水平有升高趋势，但无显著差异（P＞0.05）；不同炮制程度何首乌含药血清组有一定降低趋势，但无显著差异（P＞0.05）。

图7 不同蒸晒程度何首乌含药血清对PC12细胞因子水平的影响

2.9 何首乌对AD模型小鼠脑组织炎症因子的影响

如图8 所示，模型组的APP/PS1 双转基因小鼠脑组织中IL-1β、TNF-α、IL-6 的相对表达水平较正常对照组显著升高（P＜0.01）。P3组和P9组小鼠脑组织中IL-1β 的相对表达水平较模型组显著降低（P＜0.05）。R0 组，P3 组，P6 组和P9 组TNF-α 的相对表达水平较模型组显著降低（P＜0.05），各给药组IL-6表达水平有下降趋势。

图8 何首乌给药对小鼠脑组织细胞因子水平的影响

3 讨论

在本研究的文献整合部分，多种AD 发病机制假说相互关联。在现有研究中，β-淀粉样蛋白假说和Tau 蛋白假说在AD 的发病机制中起关键的诱导作用，Aβ 异常沉积会引起Tau 蛋白异常磷酸化，进而导致神经炎症，损伤神经元细胞。神经炎症假说和氧化应激假说等在导致AD发病过程中发挥关键作用。同时，在梳理AD 发病机制和何首乌药理作用的潜在关联后，我们发现何首乌可以在一些方面改善AD，如可拮抗Aβ 引起的认知功能降低，调节免疫功能，下调异常炎症因子的表达，减少ROS、自由基等的释放，起到抗氧化应激的作用。此外，本研究还发现，何首乌可以抑制AChE 的活性，增加ChAT的表达，从而改善神经细胞之间的信号传递。

IL-1β 具有多种功能，它对各种细胞有多种作用，具有较强的促炎活性，可诱导多种促炎介质，如细胞因子和趋化因子并导致广泛的炎症反应，IL-1β的局部激活是介导促炎反应的中心环节，导致继发性炎症介质（包括IL-6）的激活。与IL-1β 相似，TNF-α是一种多效性促炎细胞因子，属于TNF配体超家族。TNF-α在调节多种发育和免疫过程中发挥着不同的作用，包括炎症、分化、脂质代谢和凋亡，与多种疾病有关，如感染、自身免疫性疾病、癌症、动脉粥样硬化、AD等。

基于网络药理学分析结果，探讨了何首乌改善AD 的可能机制。通路富集分析表明，何首乌可通过炎症反应相关PI3K-Akt，TNF等等信号通路如发挥改善AD的作用，在PPI网络核心靶点中发现何首乌可以作用于IL-1β、TNF-α和IL-6等靶点。本研究结果发现神经炎症反应在AD 进程中发挥重要作用。近些年来，更多的研究表明AD 与炎症密切相关。临床研究发现，AD 患者的大脑表现出不同程度的炎症[24]。临床药物报告显示，经何首乌汤治疗后，AD患者外周血炎症因子水平趋于预期，智力记忆表现有所改善。PC12 细胞是来源于一种可移植的大鼠嗜铬细胞瘤，为一种实验中常用的神经细胞株。本研究使用LPS 刺激PC12 细胞造成神经炎症模型，并使用不同蒸晒程度何首乌含药血清进行干预，结果表明，何首乌含药血清可以改善LPS 造成的细胞损伤，降低炎症因子的释放。同时也发现，制何首乌改善效果优于生何首乌，说明经过“九蒸九晒”炮制后何首乌药效发生改变。中药血清药理学研究，动物灌胃给予中药，药物经吸收代谢后进入机体循环，多次给药后达到血药浓度平衡，采取血液，分离得到含有一定量该药物成分的含药血清。将血清用于干预体外细胞模型，观察其作用于细胞的药理作用。与细胞培养体系中直接添加中药提取物相比，含药血清实验可排除中药及其制剂的多种影响因素（如pH，渗透压，杂质等），使得结果更加可靠且贴近体内实验[40]。

APP/PS1双转基因AD模型小鼠[41]，可表达外源性突变的人类早老素（PS1ΔE9）和外源性人鼠淀粉样前蛋白（APPswe）融合体，其中外源基因所表达的APPswe 蛋白对β-分泌酶亲和力较内源性基因表达的APP蛋白强，故转基因小鼠脑内APP蛋白经由淀粉样蛋白代谢途径的比例会升高，进而导致生成Aβ沉积增加，而Aβ异常沉积导致神经炎症，损伤神经元细胞。通过给药后AD模型小鼠的行为学得到相当程度的改善，通过检测自发交替率和物体识别实验发现何首乌能够改善小鼠的认知障碍，同时发现P3与P6对于认知的改善作用较好。脑内炎症因子蛋白测定发现，何首乌可以显著降低IL-1β和TNF-α因子表达水平，并有降低IL-6 因子表达水平的趋势，制何首乌改善效果有优于生品的趋势。

综上所述，通过文献资源整合，网络药理学和细胞动物实验研究表明何首乌能够通过不同机制改善AD症状，改善神经炎症症状，且实验结果发现生/制何首乌作用效果存在差异，炮制后何首乌改善炎症反应的作用强于何首乌生品。何首乌炮制后成分含量的变化和药理作用的变化的关联还需要进一步的实验进行探究。