沉默circ_0007385对结肠癌细胞增殖、迁移及凋亡的影响

殷军锋 顾明

结肠癌是一种发生于乙状结肠与直肠交界处的消化道恶性肿瘤，我国结肠癌发病率与死亡率逐年上升，早期诊断及治疗是改善结肠癌病人预后的关键，因而探究结肠癌的发病机制对寻找有效的治疗方法、改善病人预后意义重大[1-2]。环状RNA(circular RNA，circRNA)在结肠癌中表达异常，并可参与结肠癌发生及发展过程[3-4]。circ_0007385在非小细胞肺癌组织及细胞中表达上调，敲低其表达可抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移及侵袭[5]。circ RNA Interactome预测显示,circ_0007385与miR-485-3p存在结合位点，研究表明,miR-485-3p在结直肠癌组织中表达下调，上调其表达可抑制结直肠癌的发展进程[6]。因此，本研究主要探讨circ_0007385是否可通过靶向调控miR-485-3p的表达而调节结肠癌细胞增殖、迁移及凋亡。

材料与方法

一、材料与试剂

收集2019年3月～2020年6月本院收治的43例结肠癌病人的结肠癌组织及其相应癌旁组织(>5 cm处的正常组织)标本，男23例，女20例，年龄50～68岁，平均年龄(55.36±3.26)岁。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求，且入组病人或其近亲属同意使用其组织样本。

人结肠癌细胞SW480购自上海奥陆生物科技有限公司；CCK-8试剂、凋亡检测试剂盒、胎牛血清、胰蛋白酶、Transwell小室购自北京索莱宝；Trizol试剂、Lipofectamine 3000 Transfection Reagent购自美国Invitrogen；反转录试剂、荧光定量PCR试剂购自美国Thermo Fisher；miR-485-3p Inhibitor、si-NC、si-circ_0007385、miR-NC、miR-485-3p mimic、购自上海吉玛制药技术有限公司；兔抗人cleaved-caspase3抗体与HRP标记的山羊抗兔IgG二抗购自北京中杉金桥生物。

二、方法

1.实验分组：SW480细胞接种于6孔板(1×105个/孔)，待细胞生长融合度达到70%时进行转染，分别稀释si-NC、si-circ_0007385、miR-NC、miR-485-3p mimic、si-circ_0007385和miR-485-3p Inhibitor，分别记为si-NC组、si-circ_0007385组、miR-NC组、miR-485-3p mimic组、si-circ_0007385+miR-485-3p Inhibitor组。同时将正常培养的SW480细胞记为control组。

2.qRT-PCR检测circ_0007385、miR-485-3p的表达水平：采用Trizol试剂分别提取癌旁组织(43例)、结肠癌组织(43例)与各组SW480细胞总RNA，测定RNA浓度后。反转录合成cDNA，将cDNA、上下游引物与实时qRT-PCR预混液混合进行qRT-PCR反应。应用罗氏LightCycler480荧光定量PCR仪检测circ_0007385、miR-485-3p相对表达量。

3.双荧光素酶报告实验检测circ_0007385与miR-485-3p的靶向关系：将WT-circ_0007385与miR-NC、WT-circ_0007385与miR-485-3p mimic、MUT-circ_0007385与miR-NC、MUT-circ_0007385与miR-485-3p mimic分别共转染SW480细胞，培养24 小时后，检测细胞荧光素酶活性。

4.CCK-8实验检测细胞增殖：收集各组SW480细胞以1×104个/孔的密度接种96孔板，分别于培养24、48、72 小时分别加入10 μl CCK-8溶液，于培养箱培养2 小时后用酶标仪检测各孔吸光度值(OD 450 nm)。

5.平板克隆形成实验：取各组SW480细胞接种于6孔板(1×103个/孔)，于37℃、5% CO2体积分数培养箱14 天后弃培养基，加入4%多聚甲醛固定20 分钟，0.1%结晶紫染色5 分钟，PBS洗涤后晾干，于显微镜下统计直径大于0.1 mm的细胞克隆形成数。

6.划痕实验：取各组SW480细胞接种于6孔板(1×104个/孔)，待细胞长满后用200 μl移液管枪头划下细胞，于显微镜下拍照(0 小时)，继续培养24 小时后于显微镜下拍照(24 小时)，应用ImageJ软件检测划痕宽度并计算划痕愈合率[(0 h小时划痕宽度-24 小时划痕宽度)/0 小时划痕宽度×100%]。

7.Transwell实验检测细胞迁移：取各组SW480细胞(1×105个/ml)加入小室的上室(200 μl/孔)，取600 μl完全培养液加入下室，于培养箱内培养24 小时。多聚甲醛固定穿膜细胞20 分钟，0.1%结晶紫染色10 分钟，显微镜下观察迁移情况，细胞迁移数以随机3个视野染色细胞数的均值表示。

8.流式细胞术检测细胞凋亡率：预冷PBS洗涤各组SW480细胞，3 000 r/min离心6 分钟，向细胞沉淀中加入500 μl结合缓冲液，重悬后按照凋亡试剂盒说明书操作并应用FACS Calibur流式细胞仪检测细胞凋亡率。

9.Western blot检测cleaved-caspase3蛋白表达量：取各组SW480细胞加入蛋白裂解液提取总蛋白，将蛋白样品与上样缓冲液混合，100 ℃孵育10 分钟，电泳反应后将蛋白质转移至PVDF膜上，用5%牛血清白蛋白封闭PVDF膜1 小时，加入内参GAPDH抗体(1∶2 000)、cleaved-caspase3一抗(1∶1 000)稀释液，4 ℃孵育24 小时，室温下加入二抗(1∶5 000)稀释液孵育2 小时。ECL发光液作用后显影，ImageJ软件分析各条带灰度值。

三、统计学分析

结果

1.circ_0007385和miR-485-3p表达的检测：结肠癌组织中circ_0007385的表达量高于癌旁组织(P<0.05)，miR-485-3p的表达量低于癌旁组织(P<0.05)，见图1A～B。采用Pearson法分析结肠癌组织中circ_0007385、miR-485-3p表达量的相关性，结果显示，circ_0007385与miR-485-3p呈负相关(r=-0.972，P<0.001)，见图1C。si-circ_0007385组circ_0007385的表达量低于control组和si-NC组(P<0.05)，见图1D。与control组、si-NC组比较，si-circ_0007385组miR-485-3p的表达量升高(P<0.05)；与control组、miR-NC组比较，miR-485-3p mimic组miR-485-3p的表达量升高(P<0.05)；与si-circ_0007385组比较，si-circ_0007385+miR-485-3p Inhibitor组miR-485-3p的表达量降低(P<0.05)，见图1E。

A：结肠癌组织中circ_0007385高表达；B：结肠癌组织中miR-485-3p低表达；C： circ_0007385和miR-485-3p负相关；D：circ_0007385表达的检测；E：miR-485-3p表达的检测注：与control组相比，aP<0.05；与si-NC组相比，bP<0.05；与miR-NC组相比，cP<0.05；与si-circ_0007385组相比，dP<0.05N：癌旁组织；C：结肠癌组织(43例)图1 circ_0007385和miR-485-3p表达的检测

2.circ_0007385和miR-485-3p靶向关系的验证：circ RNA Interactome预测显示circ_0007385与miR-485-3p存在互补序列，见图2。miR-485-3p过表达可降低WT-circ_0007385的荧光素酶活性(P<0.05)，而未能抑制MUT-circ_0007385的荧光素酶活性，见图2B。表明circ_0007385与miR-485-3p存在靶向关系。

图2 circ_0007385和miR-485-3p互补序列及荧光素酶活性检测

3.同时抑制circ_0007385和miR-485-3p对SW480增殖的检测：与control组、si-NC组比较，si-circ_0007385组细胞活力降低(P<0.05)，集落形成数减少(P<0.05)；与miR-NC组比较，miR-485-3p mimic组细胞活力降低(P<0.05)，集落形成数减少(P<0.05)；与si-circ_0007385组比较，si-circ_0007385+miR-485-3p Inhibitor组细胞活力升高(P<0.05)，集落形成数增多(P<0.05)，见表1。

表1 各个处理组细胞活性和集落形成数的检测

4.同时抑制circ_0007385和miR-485-3p对SW480迁移的检测：与control组、si-NC组比较，si-circ_0007385组划痕愈合率降低(P<0.05)，迁移细胞数减少(P<0.05)；与miR-NC组比较，miR-485-3p mimic组划痕愈合率降低(P<0.05)，迁移细胞数减少(P<0.05)；与si-circ_0007385组比较，si-circ_0007385+miR-485-3p Inhibitor组划痕愈合率升高(P<0.05)，迁移细胞数增多(P<0.05)，见表2。

表2 各个处理组细胞迁移能力的检测

5.同时抑制circ_0007385和miR-485-3p对SW480凋亡的检测:与control组、si-NC组比较，si-circ_0007385组细胞凋亡率和cleaved-caspase3蛋白水平升高(P<0.05)；与miR-NC组比较，miR-485-3p mimic组细胞凋亡率和cleaved-caspase3蛋白水平升高(P<0.05)；与si-circ_0007385组比较，si-circ_0007385+miR-485-3p Inhibitor组细胞凋亡率和cleaved-caspase3蛋白水平降低(P<0.05)，见图3、表3。

表3 各个处理组细胞凋亡率及cleaved-caspase3蛋白表达的检测

讨论

circ_0007385在非小细胞肺癌组织和细胞系中表达较高，并且与较差的总生存期相关，沉默circ_0007385可抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移及侵袭[8]。但circ_0007385在结肠癌中的表达尚未可知。

本研究结果显示，结肠癌组织中circ_0007385的表达量升高，体外细胞实验证实，沉默circ_0007385后结肠癌细胞活力降低，集落形成数与迁移细胞数减少，划痕愈合率降低。研究表明caspase3属于凋亡执行因子，其被激活后可诱导细胞凋亡[9-10]。本研究结果显示，沉默circ_0007385后结肠癌细胞凋亡率和cleaved-caspase3蛋白水平升高，提示沉默circ_0007385可促进结肠癌细胞凋亡。表明circ_0007385高表达可抑制结肠癌细胞凋亡，促进细胞增殖、迁移，从而参与结肠癌发生发展过程。

为进一步探究circ_0007385在结肠癌发生及发展过程中的作用机制，本研究证实circ_0007385基因序列上包含miR-485-3p的结合位点。研究表明，miR-485-3p在肾癌组织和细胞中表达水平降低，上调其表达可抑制肾癌细胞增殖、迁移及侵袭[11]。miR-485-3p在胶质母细胞瘤中呈低表达，上调其表达可抑制胶质母细胞瘤细胞增殖及迁移[12]。miR-485-3p在结直肠癌中表达下调，miR-485-3p过表达可靶向程序性细胞死亡受体配体1(PDL1)表达而抑制结直肠癌细胞增殖及转移并可促进细胞凋亡[13]。miR-485-3p高表达可抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移[14]。本研究结果显示，结肠癌组织中miR-485-3p的表达量降低，circ_0007385与miR-485-3p呈负相关，miR-485-3p过表达可促进结肠癌细胞凋亡，抑制其增殖、迁移能力，而抑制miR-485-3p表达可逆转沉默circ_0007385对结肠癌细胞增殖、迁移及凋亡的作用。提示circ_0007385可通过靶向调控miR-485-3p的表达而参与结肠癌发生及发展过程。

综上所述，结肠癌组织中circ_0007385的表达水平升高，miR-485-3p的表达水平降低，circ_0007385与miR-485-3p呈负相关且circ_0007385可靶向结合miR-485-3p，沉默circ_0007385可通过上调miR-485-3p表达而促进结肠癌细胞凋亡，抑制其增殖和迁移，circ_0007385/miR-485-3p可能作为结肠癌诊断的潜在生物学标志物及其治疗的潜在靶点。但circ_0007385基因序列上富含多个miRNA的结合位点，其是否可通过靶向调控其他miRNA而参与结肠癌发生及发展过程尚需进一步探究。