母乳低聚糖检测方法的研究进展

杨轶涵, 乔为仓, 张明辉, 姜铁民, 李莹, 胡聚峰, 余晓雯, 陈历俊

（1.东北农业大学食品学院, 哈尔滨 150030；2.北京三元食品股份有限公司国家母婴乳品健康工程技术研究中心北京市乳品工程技术研究中心母乳研究技术创新中心北京 100163）

0 引言

母乳是婴儿生命早期阶段营养的唯一来源。在母乳中, 母乳低聚糖（Human milk oligosaccharide,HMO）是仅次于乳糖和脂肪的第三大固体成分。目前许多研究表明, 母乳低聚糖对人体健康有着许多有利的影响。它可以促进有益菌的生长, 抑制病原菌的繁殖；可以直接调节肠道上皮细胞, 诱导其分化和凋亡, 并具有预防坏死性小肠结肠炎、免疫细胞调节和抗病毒等功能[1]。母乳低聚糖从组成结构来看可能有上千种, 但目前分离出来的只有两百种左右, 确定结构和名称的HMO只有157种[2]。母乳低聚糖的检测, 现阶段大部分还是对已有标品的HMO进行定性定量检测, 但对于检测母乳样本中HMO种类的高通量定性检测仍是一个需要攻克的难题, 所以母乳低聚糖的分离检测仍有较大的挑战。

1 母乳低聚糖的结构

在母乳中, HMO是3-10个共价连接的单糖的短链聚合物, 是仅次于乳糖和脂肪的第三大固体成分[3]。母乳低聚糖由半乳糖（galactose,Gal）, 葡萄糖（glucose,Glc）, N-乙酰氨基葡萄糖（(N-acety lglucosamine,GlcNAc）, 岩藻糖（fucose,Fuc）和唾液酸（sialic acid, Sia）5种基础单糖所组成[4]。其中唾液酸在母乳中存在形式是N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）。HMO通常根据其化学电荷可分为两类：不含电荷的单糖（Glu, Gal, GlcNAc, Fuc）组成的中性HMO和带有N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）负电荷残基的酸性HMO。唾液酸化的HMO占总HMO的12%～14%, 中性HMO可进一步分为岩藻糖基化HMO和非岩藻糖基化HMO。其中岩藻糖基化的HMO占总HMO的35%～50%, 非岩藻糖基化的HMO占总HMO的42%～55%[5]。

所有的HMO在其还原端都带有乳糖[6]。在酶的作用下, 以β-1,3或β-1,6糖苷键连接乳糖-N-二糖或N-乙酰氨基乳糖延展母乳低聚糖的核心结构, 如图1所示。在核心结构的基础上, 糖链可以继续延伸或进行岩藻糖基化和唾液酸化。α-1,2糖苷键连接Gal末端将乳糖岩藻糖基化形成2’-岩藻糖乳糖（2'-Fucosyllactose,2′-FL）, 或者以α-1,3糖苷键连接还原末端Glc岩藻糖基化形成3-岩藻糖乳糖（3-Fucosyllactose,3′-FL）。另外, 在α-2,3或α-2,6糖苷键连接Gal末端将乳糖唾液酸化, 分别生成3’唾液酸乳糖（3'-Sialyllactose,3′-SL）和6’唾液酸乳糖（6'-Sialyllactose,6′-SL）[7]。复杂低聚糖的乳糖部分和聚乳糖胺区部分都在α-2,3和α-2,6位唾液酸化, 同时也能在α-1,2、α-1,3和/或α-1,4位岩藻糖基化。

图1 母乳低聚糖的核心结构

2 母乳低聚糖含量的影响因素

母乳低聚糖存在的种类和含量会因地区、遗传、泌乳阶段等因素的影响而发生变化[8]。有研究表明78%的中国母亲的母乳中分泌2′-FL, 而菲律宾仅有46%的母乳中含有2′-FL。瑞典母亲母乳中的3’-FL的是冈比亚农村母亲母乳中3′-FL浓度的0.4倍, 瑞典母亲母乳中的二唾液酰乳酸-N-四糖(Disialyllacto-Ntetraose,DSLNT)浓度在216～614 nmol/mL之间, 而冈比亚农村母亲母乳中DSLNT的浓度在668～870 nmol/mL之间变化[9]。在整个母乳喂养期间, HMO的质量浓度也会根据哺乳阶段而发生变化：初乳中20～24 g/L, 成熟乳中12～14 g/L。母乳中HMO的组成也与Lewis血型有着密不可分的关系。这主要是岩藻糖基转移酶FUT2（Se基因）和岩藻糖基转移酶FUT3（Le基因）决定的[10]。根据FUT2和FUT3岩藻糖基转移酶的表达情况, HMO分布可以分为4组：Lewis阳性分泌型（Se+Le+）、Lewis阳性非分泌型（Se-Le+）、Lewis阴性分泌型（Se+Le-）和Lewis阴性非分泌型（Se-Le-）[11]。FUT2以α1-2糖苷键将Fuc连接至Gal末端。FUT3以α1-4糖苷键将Fuc与I型链亚末端的GlcNAc连接起来, 从而在分泌型母乳中产生Lewis b抗原, 而在非分泌型母乳中产生Lewis a抗原。2′-FL和乳糖-N-岩藻五糖（Lacto-N-fucopentaose I,LNFP I）是分泌型母乳中含量最高的HMO。相反, 在FUT2不表达的非分泌型母乳中不存在这两种HMO[12]。

3 母乳低聚糖的功能

母乳低聚糖具有促进大脑发育、调节胃肠道菌群、抗病毒、预防坏死性小肠结肠炎和上皮细胞和免疫细胞调节等作用。

母乳低聚糖与脑健康息息相关。有研究发现：2’-FL可减少脑梗塞, 神经和运动功能障碍的风险, 增加体内脑源性神经营养因子的表达。并有助于中风后大脑的神经修复[13]。

婴儿肠道菌群的定植起始于母体子宫内的阶段, 随后分娩方式, 母乳喂养方式, 断奶方式, 遗传因素, 环境因素和药物因素等会影响婴儿第一年肠道菌群的定植[14]。HMO可以不被人体胃液所破坏, 也不会被胃肠道消化酶水解, 可以直到大肠, 刺激有益微生物（主要是双歧杆菌）的生长并抑制有害菌的生长。HMO会改善婴儿肠道中的微生物种群。研究表明, 通常在母乳喂养的婴儿中定殖的拟杆菌属和双歧杆菌属能够有效地利用HMO作为碳源[15]。双歧杆菌在利用HMO时, 会产生大量的短链脂肪酸, 从而降低肠道内的pH值, 抑制病原菌的生长[16]。

新生儿的免疫系统尚未发育成熟, 母乳喂养可以一定程度上降低婴儿感染疾病的发生率。HMO不仅可以促进免疫系统的成熟, 刺激上皮细胞的免疫反应和成熟, 保护婴儿免受病毒的感染[17], 还可以与胃肠道上皮细胞以及黏膜和全身免疫细胞相互作用, 调节免疫功能或直接调节免疫反应[18]。坏死性小肠结肠炎（Necrotizing enterocolitis,NEC）是早产儿常见的一种疾病, 是早产儿死亡的重要原因。HMO对新生儿患NEC有较明显的缓解效果[19]。

4 母乳低聚糖的检测

母乳中除了HMO之外, 还含有大量的脂肪、蛋白质和糖胺聚糖等生物活性物质。所以在对HMO进行检测时, 这些生物活性物质是必须要被去除的杂质, 但HMO的分离纯化有许多的困难。首先, 母乳低聚糖中含有较多的乳糖, 乳糖的存在会影响后续HMO的分析检测。因此在对HMO进行检测前均需先进行样品前处理, 之后再对其进行定性、定量的分析。其次HMO种类繁多, 存在大量的同分异构体, 容易发生共同洗脱的现象不易分离[20]；并且没有内在的发色基团, 使其在仪器上的灵敏度较低, 这些因素都会使得HMO的分离与检测有着较大的困难[21-22]。

4.1 母乳低聚糖的分离方法

在对HMO进行分析测定之前, 需要对样本进行前处理, 即将母乳低聚糖与母乳中的脂质、蛋白质等其他成分进行分离。脂质可以通过低温高速离心的方式除去, 除蛋白的方法有以下几种, 如表2所示。有机溶剂可以使蛋白质变性沉淀, 进而去除蛋白获得低聚糖, 但易造成母乳低聚糖的损失。超滤法是将较高分子量的成分保留在膜的一侧, 从而将所需成分从液体中分离出来, 是膜分离的方法之一。超滤操作简单, 且不需要任何的化学试剂。

在分离HMO时, 乳糖也是不可忽视的成分。在母乳中, 乳糖的含量大概是HMO的7倍。对母乳低聚糖进行检测的同时, 乳糖会影响HMO的分析结果, 因此在某些实验中乳糖的去除也是不可忽视的。实验室中通常采用C18固相萃取树脂和多孔石墨化碳(PGC)来对HMO和乳糖进行分离, 两者均利用了碳水化合物的亲水性[28]。在固相萃取过程中, 低聚糖被吸附在固相萃取柱中, 而其他物质则可以顺利通过吸附剂, 从而达到分离纯化的目的。但用此方法对低聚糖进行分离时, 易造成低聚糖的大量损失[29]。葡聚糖凝胶层析也是分离纯化HMO的有效方法之一, HMO按照分子量的大小依次被洗脱出来。但随着洗脱时间的增加, 洗脱下来的乳糖含量会逐渐增多, 因此该方法需严格控制洗脱时间[30]。除此之外, 还可以通过离子交换柱层析法和活性炭柱层析法等方法来去除乳糖[31-32]。

表1 母乳除蛋白的主要方式

4.2 母乳低聚糖的检测方法

目前母乳低聚糖的检测可以通过毛细管电泳、高效液相色谱、高效阴离子交换色谱、亲水相互作用液相色谱、液相色谱-质谱联用和核磁共振等技术来实现。

4.2.1 毛细管电泳

毛细管电泳（Capillary electrophoresis,CE）在外加电场的作用下分离样品, 首先被分离洗脱出来的是带正电荷的物质, 然后是中性物质, 最后是带负电的物质。毛细管电泳时同分异构体共同洗脱的情况比较常见, 因此分离样品时可以通过使用较长的毛细管色谱柱或者在合理的时间范围内使用不同的分离缓冲液和凝胶来提高分析物各组分之间的分离度[33]。Bao Y等人通过CE-UV在205 nm的紫外吸光度处, 在35 min内定量检测母乳中12种主要的HMO, 来检测不同泌乳阶段、不同母亲母乳中的低聚糖含量变化[34]。随后Galeotti F等人在此方法的基础上改进了实验条件, 在乳糖含量较高的情况下, 分离中性HMO和酸性HMO, 并在254 nm的紫外吸光度处, 对17种中性和酸性HMO标准品进行分离和检测[35]。此后Albrecht S等人首次使用毛细管电泳与电喷雾质谱（Electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS）联用的方法, 对母乳和婴儿粪便中的低聚糖进行分离和测定, 得出HMO经在肠胃道的消化后的转化产物[36]。并且CEESI-MS/MS这种方法, 可以用aminoxyTMT衍生试剂来标记中性和唾液酸化的HMO, 提高定量分析的准确性和同分异构体的分辨率[37]。

CE除了可以检测HMO之外, 还可以研究HMO与其他碳水化合物之间的相互作用。Nakajima等人用毛细管亲和电泳法（CAE）研究了24种HMO和PAI、RCA120、SBA、WGA、UEA-I和AAL等6种凝集素之间的相互作用, 并基于实验结果, 构建了可以用来确认非还原末端单糖的数据库。并且可以利用此库, 通过凝集素的组合来表征中性HMO[38]。

4.2.2 高效液相色谱法

高效液相色谱法（High-performance liquid chromatography,HPLC）可用于对于母乳低聚糖的定量检测和结构表征。但由于母乳低聚糖的紫外线吸收能力差, 缺乏荧光特性, 因此高效液相色谱法在搭配荧光探测器时, 需要对其进行衍生化, 增加检测的灵敏度。常用的衍生试剂有：2-氨基苯甲酰胺（2-Aminobenzamide,2-AB）, 2-氨基苯甲酸（2-Aminobenzoic acid,2-AA）和2-氨基吖啶酮（2-Aminoacridone,2-AMAC）等[39]。但该方法需要通过萃取或离子交换色谱等方法来去除多余的衍生试剂, 以避免其对于分析的干扰。高效液相色谱除了可以搭配荧光探测检测器外, 还可以搭配紫外-可见光检测器、示差折光检测器和蒸发光散射检测器等。Christensen等人开发了一种高效液相色谱-折射率检测的（HPLC-RI）方法, 可以快速地在19 min内对全脂奶粉、婴幼儿配方奶粉和谷物棒中的2′-FL和3′-FL的定性定量的检测[40]。杨新磊等人通过超高效液相色谱与蒸发光散射检测器联用, 通过乳糖的标准曲线就可以完成糖浆中不同聚合度半乳糖的定量检测[41]。

4.2.3 高效阴离子交换色谱法

离子色谱（Ion Chromatography）是分析阴阳离子的一种液相色谱法。它的原理是根据被测分析物的可解离性与固定相表面带电荷的功能基团相互作用, 使待分析的物质保留在固定相上, 不同的离子因与固定相作用力的不同而得以分离的液相色谱方法[42]。该方法检测准确, 分析速度快, 灵敏度高, 无需衍生, 并且可以同时测定多个待分析物质的量, 避免了HMO因衍生化而产生的误差, 适用于复杂HMO混合物的定性和定量分析[43-44]。

高效阴离子交换色谱（High-pH anion-exchange chromatography,HPAEC）可以用于对HMO进行分离, 常与脉冲安培检测器（Pulsed amperometric dector,PAD）进行联用。PAD检测灵敏度较高, 但它只能在碱性条件下使用, 因此通常情况下, 离子色谱检测时流动相是NaOH和NaOAc[45]。1996年Thurl等人首次用HPAEC-PAD对14种中性HMO和6种酸性HMO进行定量加检测[46]。此后, 许多研究实验都用高效阴离子交换色谱法来对HMO进行检测研究：朱伟等人用HPAEC-PAD测定婴幼儿配方奶粉中蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖、棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖等8种功能性低聚糖含量[47]。Coppa G V等人则用该检测方法定量测定18位母亲在哺乳期三个月内21种母乳低聚糖在不同阶段的动态变化, 发现所有的HMO在产后第4天的含量最高, 而到了第30天时则减少了20%[48]。

4.2.4 亲水相互作用液相色谱法

亲水相互作用液相色谱法（Hydrophilic interaction chromatography,HILIC）的保留分配机制与氢键作用、偶极作用和静电作用等多种效应密切相关。HILIC是分析HMO常用的分析方法之一, 有时也会被称为正相色谱法。该方法非常适合分离较大质量的HMO和HMO的异构体, 但对相似的质量较小的碳水化合物分析效果不佳。Sean等通过亲水相互作用液相色谱与荧光检测(HILIC-FLD)将2′-FL和乳糖基-N-新四糖（Lacto-N-neotetraose,LNnT）分离开来, 对这两种低聚糖进行定性定量的检测。随后将该方法与HPAEC-PAD进行比较, 应用到商业工厂样品中, 发现FLD在分离低聚糖时, 破坏了产品配方基质间的相互作用, 使其分离效果好于HPEAC-PAD[49]。

4.2.5 液相色谱-质谱联用法

液相色谱可以与检测结构信息的MS检测系统联用, 其原理是当样品通过色谱柱后, 各组分之间实现分离, 待分离组分到达离子源时, 将待测组分进行分子离子破碎, 产生大量碎片并对其进行分析。该方法不仅可以通过峰面积对其进行定量分析, 还可以通过质谱碎片进行结构的分析以及定性的检测。该方法缩短了分析时间, 是目前分析低聚糖的重要手段之一。Wu等人通过液相色谱-飞行时间质谱法产生的诊断峰和特征碎片来区分同分异构体, 建立了一个30个SHMO的数据库和一个含有45个中性HMO的数据库[50-51]。张文源等人用液相色谱-质谱法成功分离出LNFPⅠ和LNFPⅢ；LSTa、LSTb和LSTc；2′-FL和3′-FL；3′-SL和6′-SL等4对同分异构体, 并成功定量测量了12种HMO[52]。Tedesco等人开发了一种HPAEC与质谱检测仪联用的方法来测定蜂蜜样品中碳水化合物组成, 并用该方法成功地对7个单糖、8个二糖、4个三糖和1个四糖进行了定量检测[53]。Rudd P M用HILIC-HPLC和外聚糖苷酶消化法鉴定了牛初乳中33种不同的结构牛乳低聚糖。并结合MS, 识别了含有Neu5Gc的4种唾液酸化结构的牛乳低聚糖[54]。Fong B等人也在此方法的基础上, 测定了成熟牛乳、牛初乳和婴儿配方奶粉中3′-SL, 6′-SL, 3′-SLN、6′-SLN, 二唾液酸乳糖(DSL)和N-乙酰半乳糖胺基乳糖(GNL)等6种HMO的含量[55]。美国学者Remoroza等人通过亲水相互作用液相色谱-电喷雾电离串联质谱法, 建立了1个含有74种HMO的质谱参考图库[56]。Yan等人则是将固相萃取、亲水相互作用色谱法和质谱法结合起来, 测定了1周至4个月期间酸性母乳低聚糖的含量变化[57]。

4.2.6 核磁共振技术

核磁共振技术（NMR）的原理是低能态的原子核磁矩在恒定场强和交变场强的相互作用下吸收了由交变场强提供的能量后, 跃迁至高能态的原子核磁矩, 从而产生核磁共振信号。NMR技术常应用在HMO结构的分析, 目前研究应用比较广泛的是1H NMR。Van等人提出了一种1H NMR快速分析的方法, 该方法可识别α1-2、α1-3和α1-4糖苷键连接的岩藻糖残基在HMO样品中是否存在, 并用该方法对36种HMO样本进行分析, 成功将36个样本分成Lewis阳性分泌型；Lewis阳性非分泌型；Lewis阴性分泌型和Lewis阴性非分泌型四组[58]。目前1H NMR也可用于检测尿液和粪便样品中的HMO, 来分析婴儿肠道中HMO的代谢特征, 而且现在也可以运用多维核磁共振光谱对HMO进行分析[59]。

4.2.7 其他

还有一些其他的方法也可用于分析HMO。刘世伟等人通过二氧化碳超临界流体色谱法分离了18种母乳低聚糖复杂的同分异构体[60]。Mernie等人通过薄层色谱-质谱法对25种HMO进行快速地分离鉴定, 并通过该方法对不同时期的母乳低聚糖进行了定量检测[61]。

目前可以就用来检测HMO的方法众多, 但每种检测方法均有利弊, 其效率和准确性还有待进一步地提高, 如表2所示。现阶段HMO的定量检测较为简单, 但HMO的高通量检测仍是需要攻克的难题。

表2 母乳低聚糖主要检测方法及其优缺点

5 结论

母乳中可能含有上千种低聚糖, 但确定名称和结构的HMO有157种。而且由于地区、泌乳阶段、遗传等因素的影响, HMO种类和含量会发生变化。目前可以通过毛细管电泳、液相色谱或液相色谱-质谱等方法对HMO进行定性定量的检测。但目前检测大量样品及多种HMO的高通量定性检测还有待进一步的发展。

目前国际上添加到婴幼儿配方奶粉中的HMO主要有：2′-FL、LNnT、3′-GL、3′-SL和6′-SL等。但是我国目前婴幼儿配方奶粉中允许添加的低聚糖只有低聚半乳糖、低聚果糖、多聚果糖、棉子糖和聚葡萄糖等, 所以我国第五代婴幼儿配方奶粉的发展目标之一就是优化碳水化合物成分。开发出对样品中HMO进行高通量定性检测的方法, 并与现有的母乳低聚糖定量检测方法结合, 去检测不同地区不同泌乳阶段的母乳, 总结HMO的种类和含量的变化规律。这将以便于以后对0～6个月、6～12个月和12～24个月不同阶段的婴幼儿配方奶粉中HMO种类和含量的添加提供依据, 有利于配制出与母乳最为接近的婴幼儿配方奶粉。