基于超声-等离子体改性曲拉制备酪蛋白酸钠的工艺研究

董爽, 王世荣, 尚雅蕾, 宋昱珠, 李晓宇, 郑凤华

（山东理工大学农业工程与食品科学学院, 山东 淄博 255000）

0 引言

酪蛋白酸钠是以牦牛乳为主要生产原料进行精致加工得到的一种白色酸性固体, 溶于水后呈淡黄色液体[1-2], 是集乳化性、起泡性、保水性等功能特性和高营养价值于一体的优良食品配料[3-4]。曲拉是藏区牧民利用牦牛乳预煮加热、杀菌、发酵、加热凝块、脱水所制得的粗酪蛋白, 是我国所特有的资源[5-7]。曲拉中含有丰富的蛋白质, 有利于提高人体免疫力、维持人体肠道正常菌群的稳定和平衡等功能[8-9], 其中酪蛋白含量占蛋白质总含量的80%左右, 是一种理想的制备酪蛋白酸钠的原料。目前, 用曲拉制取酪蛋白酸钠有酸析法[10]、直接浸泡法[11]、再提纯法[2]等。以上方法虽然取得一定成效, 但由于工艺复杂、化学物质残留、纯度低、提取率低等缺点, 未得到充分的推广和应用, 需要探究一种清洁环保, 可有效提高酪蛋白溶出率的方法。

超声波为频率20 kHz至100 MHz的机械波, 其在介质中传播时会引起介质粒子高频率的机械振动, 有助于提高蛋白质的溶解率[12-13]。Moulton等研究[14]通过超声波技术对大豆蛋白进行提取, 发现大豆蛋白质提取率由30%提高到80%。梁汉华等研究[15]通过利用低频超声波技术处理了大豆浆体和其他豆渣, 促使蛋白质和固形物的萃取率提高。朱建华等人[16]利用超声处理技术从玉米中提取水分和稻谷蛋白质, 研究了超声处理时间、超声处理能力和功率等因素对提取效果的作用, 结果有效地证实了超声处理技术能够有效地改善蛋白质的溶出度。等离子体是一种准中性电离气体, 由电子、离子、自由基、激发态原子和大量结合的中性分子组成[17-18]。其中, 低温等离子体能够使食品的物理化学性质发生改变, 使食物中酶失活[19]并诱导表面亲/疏水性改变[20]。研究表明, 延长等离子体处理时间会使蛋白质结构展开并重聚形成大的蛋白质聚集体, 使得蛋白质部分氧化, 泡沫稳定性有显著提高[21]。前期试验发现, 超声波和等离子体对于曲拉中蛋白质溶出均具有明显效果, 但其增溶工艺及具体的影响规律尚不明晰。

基于此, 本研究将超声波技术和等离子体技术相结合对曲拉进行改性处理, 提高酪蛋白溶出率, 从而增加酪蛋白酸钠产率。本研究有助于提高曲拉的工业利用率, 为高效制取酪蛋白酸钠提供了新的方法和理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

曲拉, 甘南州科瑞乳品开发有限公司；酪蛋白酸钠, 和政县华龙乳制品有限公司。

JY 99-ⅡD型超声清洗机, 北京佳源兴业科技有限公司；CTP-2000R型介质阻挡低温等离子体处理仪, 南京苏曼科技有限公司；HwS-28型电热恒温水浴锅, 上海一恒科学仪器有限公司；Sorvall BP 8型高速离心机, 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；CM-3600A型色差仪, 绍兴市卫星医疗设备制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酪蛋白酸钠的制备工艺[22-23]

参考胡涛等研究[2]的方法用曲拉制备酪蛋白酸钠, 具体试验步骤如下。

曲拉悬浮液→超声处理→等离子体处理→调整pH至8.5→磁力搅拌→过滤→离心取上清液→加酸沉淀→酪蛋白凝块→加水研磨→碱溶→加热→冷冻干燥→酪蛋白酸钠

1.2.2 超声协同等离子体改性处理

固定基础水平为超声处理时间7 min, 超声处理功率应400 W, 等离子体处理时间5 min, 等离子体处理功率60 W, 分别在超声处理时间1、3、5、7、9、11 min；超声处理功率300、350、400、450、500 W；等离子体处理时间1、3、5、7、9 min；等离子体处理功率40、50、60、70、80 W下处理曲拉悬浮液, 获得不同处理条件的样品。之后用5 mol/L的氢氧化钠调节体系的pH为8.5, 经过300 r/min磁力搅拌均匀, 55℃下加热30 min。经过100目纱布过滤后取滤液进行离心脱脂（3 000 r/min 20 min）, 收集上清液采用双缩脲法测定溶解的蛋白质浓度。

1.2.3 响应面优化试验

以上清液蛋白质浓度为响应值, 设置四因素三水平的响应面试验, 优化超声-等离子体处理曲拉制酪蛋白酸钠的工艺条件, 自变量因素编码及水平, 见表1。

表1 响应面试验设计因素水平表

1.3 仿制奶酪的制备工艺

以酪蛋白酸钠为蛋白基制备仿制奶酪。首先, 将各物料按比例（54.0%饮用水、17.0%植物油、15.0%酪蛋白酸钠、0.5%瓜尔豆胶、10.0%马铃薯淀粉、1.5%白砂糖、1.5%三聚磷酸钠、0.5%乳酸）依次加入并搅拌均匀。置于80℃水浴锅加热10 min后对混合物料进行高速剪切。随着温度升高, 混合物从液态状逐渐变为黏稠状。当中心温度达到70℃时换成搅板继续搅拌5 min。待冷却后得到光滑、均一、可拉丝的仿制奶酪。为了分析超声-等离子体的作用效果, 实验中以市售酪蛋白酸钠（市售组）以及未经超声-等离子体处理, 其余步骤处理参数与优化组保持一致的酪蛋白酸钠样品为对照（对照组）。

1.4 仿制奶酪功能性质的测定

色度值：采用色差仪测定奶酪样品的L*、a*、b*值。

感官评定：组织10名感官评价人员, 根据表2中仿制奶酪的感官评价标准从口感、风味、组织状态等方面对样品进行感官评定。

表2 仿制奶酪感官评价

1.5 数据统计分析

所有试验每组均设置3次平行试验, 结果均表示为平均值±标准偏差, 采用IBM SPSS Statistics 20软件对数据进行显著性分析。采用Design-Expert 8.0.6 Trial软件进行响应面试验设计, 采用Origin 8.0进行图片绘制。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 超声处理时间对蛋白质浓度的影响

如图1所示, 与未经超声处理的样品（0 min）相比, 经过超声处理后, 曲拉溶液中的蛋白质浓度均显著高于对照组（P＜0.05）。表明超声处理可有效促进曲拉中蛋白质的溶解, 提高溶解度。此外, 随着超声处理时间增加, 曲拉上清液中蛋白质浓度呈先下降后增加再下降的趋势。当超声处理3～9 min时, 随着超声处理时间的增加, 蛋白质溶解度不断增加, 在9 min时达到最高点。这是因为超声波引起水分子的强烈振动, 增强了介质之间的相互作用, 促进了蛋白质分子的溶解, 增大了溶解度[12]。然而当在较长的超声时间下（9 min）, 曲拉溶液中蛋白质发生了部分聚集[24], 导致蛋白质浓度不升反降。

图1 超声处理时间对曲拉溶液中蛋白质浓度的影响

2.1.2 超声处理功率对蛋白质浓度的影响

由图2可知, 不同超声功率下曲拉溶液中蛋白质浓度均显著高于未处理（P＜0.05）。随着超声处理功率的增加, 蛋白质呈现先增加后降低的趋势, 在超声处理功率350 W时达到最高点。可见在一定超声功率下（300～350 W）, 曲拉中蛋白质溶出率与超声功率呈正相关。此外, 在350 W之后蛋白质溶解度呈现下降趋势, 这可能是与蛋白质在较高的超声强度下发生了部分变性有关。

图2 超声处理功率对曲拉溶液中蛋白质浓度的影响

2.1.3 等离子体处理时间对蛋白质浓度的影响

由图3可知, 在较短的等离子体处理时间内（0.5 min）, 曲拉溶液蛋白质浓度相比未处理并没有显著增加（P＞0.05）。随着处理时间的延长, 在1.0 min后蛋白质浓度有明显的增加趋势, 1.5 min时达到最大值。当处理曲拉溶液时, 等离子体中的高能粒子可增强蛋白质与溶剂之间的相互作用, 蛋白质肽链舒展, 暴露出更多的亲水基团, 因而获得更高的溶解性。但当等离子体处理时间超过1.5 min后, 蛋白质浓度趋于下降, 在处理时间2.5 min时蛋白质浓度甚至低于未处理。其原因可能是随着等离子体处理时间的延长, 曲拉蛋白中羰基不断增加, 游离巯基不断减少, 蛋白质氧化程度加深, 蛋白质结构又相互连接, 重聚形成了更大的蛋白质聚集体, 蛋白质浓度表现为缓慢下降[24]。图3结果表明, 等离子体在一定处理时间内（1.0～2.0 min）可有效提高曲拉溶液中蛋白质溶解度。

图3 等离子体处理时间对曲拉溶液中蛋白质浓度的影响

2.1.4 等离子体处理功率对蛋白质浓度的影响

由图4可知, 在较低（40 W）和较高（80 W）等离子体处理功率下, 曲拉中蛋白质浓度值相比未处理有所降低。而在50～70 W处理功率区间内, 蛋白质浓度有明显提高（P＜0.05）。其中等离子体处理功率60 W时, 蛋白质浓度达到峰值。这是由于试验中采用的等离子体放电模式为介质阻挡型放电, 低处理功率下不足以导致电压击穿, 形成均匀、散漫的放电细丝, 导致曲拉溶液处理不匀。而在过高的功率下, 处理强度较大, 局部出现由于过度放电产生的电弧, 导致蛋白质由于温度过高发生变性。

图4 等离子体处理功率对曲拉溶液中蛋白质浓度的影响

2.2 超声协同等离子体处理技术的响应面试验优化

2.2.1 响应面试验结果

表3是通过Design Expert 8.0.6软件进行响应面试验设计, 在不同的超声处理时间（A）、超声处理功率（B）、等离子体处理时间（C）、等离子体处理功率（D）处理条件下曲拉溶液中的蛋白质浓度值（Y）。

2.2.2 响应面回归模型的建立与方差分析

在表3试验结果的基础上, 以蛋白质浓度为响应值, 通过Design-Expert 8.0.6软件对数据结果进行回归模型分析, 并建立二次响应回归模型, 得到如下回归方程：

其中, A为超声处理时间, min；B为超声处理功率, W；C为等离子体处理时间, min；D为等离子体处理功率, W；Y为曲拉溶液中蛋白质浓度, mg/mL。因素之间交互作用的响应面及等值线图如图5所示。此外, 对回归方程进行方差, 结果如表4所示。其中, P＜0.05为显著, P＜0.01为极显著。

图5 因素的交互作用对曲拉溶液中蛋白质浓度的响应面立体图及等值线图

表4 回归方程系数显著性分析结果

（续表4）

由表4结果可知, 本响应面试验建立的模型P＜0.01, 为极显著, 且失拟项为0.8824, 为不显著（P＞0.05）, 模型的R-Squared为0.8085, C.V.%为10.62, 表明响应面回归模型可信度较高。一次项A对蛋白质浓度的影响为显著, D为极显著, 二次项B2、C2为极显著, 其余项为不显著。各因素对上清液蛋白质浓度影响的大小顺序依次是D（等离子体处理功率）＞A（超声处理时间）＞C（等离子体处理时间）＞B（超声处理功率）。

2.2.3 最优工艺的确定及验证试验

通过软件对回归方程模型进行优化求解, 得到曲拉溶液最优增溶工艺为：超声处理时间9 min, 超声处理功率345.11 W, 等离子体处理时间1.50 min, 等离子体处理功率70 W。考虑到实际试验中设备的可操作性, 将最优工艺参数校正为：超声处理时间9 min, 超声处理功率350 W, 等离子体处理时间1.50 min, 等离子体处理功率70 W。进行3次平行试验取平均值, 3次验证试验平均值与理论值接近, 表明该模型准确、有效。在最优工艺条件下, 蛋白质浓度达到2.64±0.10 mg/mL。

2.3 酪蛋白酸钠应用于仿制奶酪中的品质评价

2.3.1 色度值

为了评价酪蛋白酸钠在真实食品体系中的应用性, 本文以酪蛋白酸钠为蛋白质来源制备了仿制奶酪。按照酪蛋白酸钠的不同将奶酪样品分为对照组、优化组和市售组, 分别对3种仿制奶酪的L*（亮度）、a*（红绿）、b*（黄蓝）值进行测定, 结果如表5所示。由表5可知, 对照组的奶酪L*值最大, 即亮度最大, 相比之下优化组的奶酪亮度最低。a*值大小排序为市售组＞对照组＞优化组, 优化组的奶酪样品偏绿。由b*值可知, 优化组颜色偏黄, 与市售组更为接近, 其b*值无显著差异（P＞0.05）。这是由于超声和等离子体处理可能会引发一定程度的美拉德反应, 导致样品颜色变暗变黄。

表5 不同酪蛋白酸钠来源的仿制奶酪色度值

2.3.2 感官评价

根据感官评价表分别对3种仿制奶酪样品进行风味、口感等方面的感官评价, 所得结果如图6所示。优化组奶酪在咀嚼性、胶黏性、咸味、奶酪香气这4方面优化组与市售组接近。但在紧实度、质地与硬度与市售组相比仍有一定差距。其原因主要是由于等离子体改性处理, 使曲拉中蛋白质多肽链结构松散, 一定程度上降低了结构强度。在等离子体改性大豆分离蛋白（SPI）中研究中也有类似的结论[25]。

图6 不同酪蛋白酸钠来源的仿制奶酪感官评分

实验中对3组仿制奶酪进行拉伸性测试, 由结果可知, 经过多次拉伸实验, 优化组所得奶酪质地均匀、细腻、连续, 其最大拉伸长度与市售组接近如图7所示。这表明采用超声协同等离子体处理曲拉制备的酪蛋白酸钠可作为蛋白基应用于仿制奶酪中, 其品质一定程度上与市售组接近。

图7 不同酪蛋白酸钠来源的仿制奶酪拉伸性

3 结论

综上可知, 超声-等离子体处理可有效提高曲拉溶液中蛋白质溶解度。各因素对曲拉中蛋白溶出率的影响程度为等离子体处理功率＞超声处理时间＞等离子体处理时间＞超声处理功率。响应面试验得出曲拉的最优增溶工艺条件为超声处理时间9 min, 超声处理功率350 W, 等离子体处理时间1.50 min, 等离子体处理功率70 W。在最优工艺条件下, 曲拉中溶出的蛋白质浓度达到2.64±0.10 mg/mL。优化组仿制奶酪在咀嚼性、胶黏性、咸味、奶酪香气、拉伸性能等方面与市售组接近。