以HER2为靶点的乳腺癌双模态纳米探针的制备与实验研究

高晓隆，田洪达，尹强强，谷弘谦，尹汇敏，刘强，刘力

1.齐齐哈尔医学院 医学技术学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.齐齐哈尔市第一医院 影像中心，黑龙江 齐齐哈尔 161005

引言

乳腺癌是常见的临床恶性肿瘤[1]，据统计，在导致女性死亡的恶性肿瘤中，乳腺癌居于首位，且其发病率及死亡率呈逐年增加的趋势[2]。人表皮生长因子受体2（Human Epidermal Growth Factor Receptor 2，HER2）过表达在乳腺癌患者中约占30%，且过表达的HER2乳腺癌患者通常存在预后不良[3]。目前，主要采用超声、钼靶X线和磁共振等影像学方法对乳腺癌进行诊断，然而，以上检查方法均是基于病变的大体形态和结构的观察，发现时多为中晚期，并且对乳腺癌早期小病灶、甚至进展期可能存在漏诊、误诊的情况，从而影响或延误患者治疗[4-5]。研究表明，Ⅰ～Ⅱ期原发乳腺癌患者5年生存率较Ⅲ～Ⅳ期提高约50%[6]，因此，乳腺癌的早期诊断至关重要。近年来，随着分子影像学技术的迅猛进展，其可从分子水平检出病变，以实现病变早期治疗的目的，故分子影像学在乳腺癌的发生、进展、转归以及评价治疗效果、病变定位等方面获得了广泛地应用。有研究者运用单模态影像探针诊断疾病，然而单模态探针具有一定的假阴性和假阳性，无法对疾病达到精准诊断，双模态或多模态可以弥补单一模态探针不足，从而实现对疾病的精准诊断，成为分子影像学未来的发展趋势[7]。曲妥珠单抗（Trastuzumab）是一种能与HER2受体的膜外特异性结合的单克隆抗体，可广泛应用于乳腺癌HER2阳性的靶向治疗[8-10]，选用Trastuzumab与HER2阳性细胞特异性结合，制备具有荧光和磁共振功能的双模态探针，对乳腺癌进行早期诊断、预后评估具有重要意义。基于此，本研究旨在将Trastuzumab作为靶向物质，偶联能够缩短T2弛豫时间、具有良好空间分辨率的Fe3O4，以及拥有较好灵敏度、抗干扰能力的荧光染料Cy5.5，制备一款对HER2阳性乳腺癌具有靶向性的荧光/磁共振双模态纳米探针，检测其表征并验证其体外靶向能力。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

荧光染料Cy5.5购自索莱宝生物科技有限公司，聚乙二醇（Polyethyleneglycol，PEG）购自西安瑞禧生物科技有限公司，PBS缓冲液、DMEM细胞培养基购自Hyclone公司（美国），SKBR-3细胞购自中国科学院上海细胞库，DAPI荧光染料购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 实验仪器

激光共聚焦显微镜（LSM710，德国蔡司）；1.5 T磁共振（PHILIPS）；核磁共振造影剂弛豫率分析与成像系统（NM120，苏州纽迈公司）；粒度分析仪（NICOMP-380ZLS，美国PSS）；荧光分光分度计（RF-5301PC，日本岛津）；集热式恒温加热磁力搅拌器（DF-101S，巩义予华仪器有限公司）；数显智能控温磁力搅拌器（HJ-3A，江苏正基仪器有限公司）；超声清洗仪（XM-3200UVF，昆山禾创超声仪器有限公司）。

1.3 Fe3O4-Cy5.5-trastuzumab双模态探针合成

取PEG化的Fe3O4（两端为羧基）置于离心机15000 r/min，离心15 min。加入NaHCO3溶液调节pH为7.5，加入荧光染料Cy5.5，在37℃下置于恒温摇床孵育过夜，用100 kD超滤管超滤除去未反应的Cy5.5，加入二乙基二乙氨丙酯和N-羟基丁二酰亚胺活化1 h上述溶液，再加入Trastuzumab，室温下孵育摇床过夜，用100 kD超滤管过滤，除去未反应的Trastuzumab。得到双模态纳米探针Fe3O4-Cy5.5-trastuzumab。

1.4 Fe3O4-Cy5.5-trastuzumab探针的表征

1.4.1 透射电镜尺寸的测定

用移液管吸取少量Fe3O4-Cy5.5-trastuzumab溶液，稀释后滴于电镜铜网上，待样品干燥后在透射电子显微镜下进行观察，对100个纳米颗粒直径进行测量，计算出平均粒径。

1.4.2 水合粒径及zeta电位的测定

（1）水合粒径测定：在室温下，取超滤后的Fe3O4-Cy5.5-trastuzumab 1mL，稀释后放于Eppendorf管中，置于超声波振荡器中振荡15 min，打开激光粒度检测仪，进行预热，将Eppendorf管中的液体移入透明的比色皿中，外部擦拭干净放于机器中进行测试，运用动态光散射法测量Fe3O4-Cy5.5-trastuzumab的水动力尺寸，重复3次计算平均值。

（2）zeta电位测定：在室温下，取Fe3O4-Cy5.5-trastuzumab 1mL，稀释后放于Eppendorf管中，置于超声波振荡器中振荡15 min，打开激光粒度检测仪，进行预热，将Eppendorf管中的液体，移入透明的比色皿中，外部擦拭干净放于机器中选用zeta模式进行测试，重复测量3次zeta电位取平均值。

1.4.3 光学性质测定

取Fe3O4-Cy5.5-trastuzumab溶液，用移液枪移入石英比色皿中，检测400～800 nm波段的吸收；取相同浓度的溶液，用荧光检测仪测定探针的荧光强度。

1.4.4 弛豫率检测

用移液枪将Fe3O4-Cy5.5-trastuzumab溶液配置成4个不同浓度（25.0、50.0、75.0、100.0 μg/mL），分别装入玻璃管中，每管溶液为1 mL，分别放于纽迈小核磁分析仪中进行检测，选择EDUMR20-015V-1，序列为CPMG，参数：SF ：21 MHz，O1：569335.95 Hz，P1：14.00 μs，TD ：29994，PRG：1，TW：300.000 ms，P2：25.00 μs，TE：0.300 ms，NECH：1000，NS：8。

1.5 细胞毒性

选取对数生长期状态良好的SKBR-3人乳腺癌细胞，经胰酶消化后，放于96孔板中，周围1圈用磷酸缓冲液填充，缓解试剂蒸发，避免边缘效应。将96孔板放于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h，分别向96孔板加入浓度为0、25、50、75、100 μg/mL的纳米探针，孵育过夜，向样品孔中加入10 μL CCK-8溶液，继续培养2～4 h。在酶标仪450 nm吸光度下，检测细胞毒性。

1.6 激光共聚焦显微镜

选用生长状态良好的乳腺癌细胞SKBR-3，置于激光共聚焦专用孔板中，在条件为37℃、5% CO2培养箱中过夜，用荧光显微镜观察细胞贴壁情况，用磷酸缓冲液冲洗3次，加入不同浓度的Fe3O4-Cy5.5-trastuzumab溶液，再加入DMEM培养基，培养过夜，用PBS缓冲液冲洗3次，最后加入DAPI染色15 min，在激光共聚焦镜下观察荧光分布。

2 结果

2.1 纳米探针的表征

透射电镜显示纳米探针的纳米粒子大小均匀，形态为球形，分散性较好，粒径大小（85.67±11.46）nm，见图1；水合粒径大小为（93.72±6.34）nm，且探针尺寸分布较窄，分布性较好，见图2；测得zeta电位大小为（-21.54±3.23）mV，见图3；在荧光上可以看到荧光染料Cy5.5的特征吸收峰，在荧光光谱上690 nm处，检测到探针有吸收峰，见图4。

图1 Fe3O4-Cy5.5-trastuzumab电镜图

图2 水合粒径分布

图3 Fe3O4-Cy5.5-trastuzumab的zeta电位

图4 Fe3O4-Cy5.5-trastuzumab荧光光谱

2.2 弛豫率

经1.5 T磁共振，检测不同浓度下的探针信号强度（图5）；运用纽迈小核磁检测仪，检测4种不同浓度（25.0、50.0、75.0、100.0 μg/mL）下的T2弛豫时间，经OriginPro 2020线性拟合，得出探针的弛豫率为42.286 mM-1s-1，R2=0.9886（图6）。

图5 Fe3O4-Cy5.5-trastuzumab

图6 Fe3O4-Cy5.5-trastuzumab纳米探针弛豫率

2.3 细胞毒性

用CCK-8法检测Fe3O4-Cy5.5-trastuzumab对乳腺癌细胞SKBR-3的细胞毒性，经酶标仪检测450 nm处的OD值，显示Fe3O4逐渐升高时，细胞的活性逐渐减低，当浓度达到100 μg/mL时，细胞的活性仍在75%以上，说明此探针对细胞毒性较低（图7）。

图7 细胞毒性

2.4 激光共聚焦细胞成像

经激光共聚焦显微镜观察乳腺癌SKBR-3细胞摄取Fe3O4-Cy5.5-trastuzumab的情况，24 h后，激发光源激发探针发出红光，提示Fe3O4-Cy5.5-trastuzumab被SKBR-3细胞所摄取，DAPI染细胞核为蓝色（图8）。

图8 激光共聚焦显像

3 讨论

HER2阳性乳腺癌通常具有较高的侵袭性，且易耐药、预后差，因此，靶向HER2对其检测和治疗有重要的意义[11]。本研究旨在探究靶向双模态纳米探针对HER2阳性乳腺癌的成像性能。

磁共振成像具有无电离辐射、细微病灶清晰可见的特点，本实验运用分子影像研究较多的核磁阴性对比剂Fe3O4，在磁共振分子显像中除应用Fe3O4作为对比剂外，也有研究者开发了其他新型磁共振对比剂，如贵金属纳米粒子、磁性脂质体、纳米碳管等[12]。目前，T1WI序列的钆对比剂在临床中应用较多，但自由钆离子毒性较强，不仅易在脑内沉积，还可引起肾纤维化[13]。与传统的钆剂相比，Fe3O4具有稳定性好、形态稳定、分散性好以及不易被肝脾脏器摄取造成脏器损伤的特点[14-15]，此外，Fe3O4还具有丰富的表面活性基团，易被表面化学修饰，本研究运用PEG包裹Fe3O4，不但可以增加Fe3O4的水溶性，而且具有毒性低、稳定性好、生物相容性等特点，在其表面连接相应配体，即可主动靶向于肿瘤，实现靶向性诊断。

荧光染料Cy5.5为近红外成像物质，易溶于水，属于花菁类染料，较传统荧光染料，其生物安全性、荧光量子产率更高，pH环境对其影响小，在近红外区域内，荧光更加稳定，强度更强[16-17]，有望代替放射性核素显像。Oghabian等[18]成功构建的Herceptin-USPIO探针，在HER2阳性乳腺癌小鼠中经磁共振检查，验证了其良好的T2负性增强效果；朱亮等[19]将Pep12与USPIO共轭连接Pep12-USPIO，应用该探针在体外乳腺癌MCF-7细胞株中验证了其靶向成像性能；吴琬璐[20]成功制备了靶向乳腺癌CD44-WCMSNs磁共振诊疗一体化探针，通过实验证明了其具有良好的生物相容性和磁共振T1的成像能力。虽然磁共振成像具有较高的密度分辨率，但其敏感性相对较低，而荧光成像具有较好的穿透性和敏感性，但不能显示病灶的解剖结构及精准定位[21]，本研究将2种成像方式融合，利用双模态成像期望精准诊断HER2阳性乳腺癌。

本研究结果表明，Fe3O4-Cy5.5-trastuzumab纳米探针，测得水合粒径大小为（93.72±6.34）nm，zeta电位为（-21.54±3.23）mV，电位大小可反映纳米探针的稳定性，电位在±30 mV左右表明有较好的稳定性，本实验所合成的纳米探针zeta电位在此范围左右，说明具有较好的稳定性。弛豫率大小为42.286 mM-1s-1，高于传统钆剂弛豫率，在磁共振T2WI扫描序列下，随着探针浓度的增加，其核磁信号强度逐步下降，进一步证明所制备纳米探针具有T2阴性对比剂的特有性能。荧光光谱显示Fe3O4-Cy5.5-trastuzumab纳米探针出现Cy5.5的特征吸收峰，也表明了该探针的荧光性能。

激光共聚焦显微镜是验证抗原抗体结合的有效方法，可从亚细胞层面上显示抗原抗体的结合。为检测偶联了Trastuzumab单克隆抗体的双模态纳米探针Fe3O4-Cy5.5-trastuzumab与HER2阳性肿瘤细胞的结合情况，本研究运用了激光共聚焦显微镜可观察到的细胞核呈蓝色，细胞表面为红色，说明Fe3O4-Cy5.5-trastuzumab纳米探针与SKBR-3细胞膜表面结合，说明该探针对此细胞有良好的靶向性。

本研究尚存以下不足：仅对Fe3O4-Cy5.5-trastuzumab纳米探针进行了表征和初步的体外实验的研究，今后还需进一步对所合成探针进行体内动物实验研究，验证其成像效果及靶向能力。

4 结论

本实验所制备的双模态Fe3O4-Cy5.5-trastuzumab纳米探针，具有毒性低、生物相容性好、靶向性好的特点，同时具有磁共振的高对比度和荧光的高敏感性，弥补了单一模态的成像缺陷，有望为HER2阳性乳腺癌进行早期诊断提供一定的理论依据。