染色体微阵列分析技术在马蹄足内翻胎儿中的应用价值

罗晓辉，周伟宁，李怡，任丛勉，黄演林，卢建

马蹄足内翻（talipes equinovarus，TE）是常见的出生缺陷，活产儿中发病率为1‰～3‰，男女比为2∶1[1]。TE发病原因不明确，与神经肌肉病变、骨骼发育异常和遗传因素等有关，约20%的TE与染色体非整倍体、微缺失/微重复综合征相关。拷贝数变异（copy number variation，CNV）通常指＞1 kb的DNA片段的拷贝数增加或减少，染色体微阵列分析（chromosome microarray analysis，CMA）技术可以检测大于100 kb的CNV。本研究对157例超声提示为TE的胎儿进行CMA检测，旨在探讨CMA技术在产前TE胎儿中的临床应用价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象收集2016年1月—2020年7月在广东省妇幼保健院（我院）产前诊断中心就诊的孕妇因胎儿超声提示TE接受介入性产前诊断并行CMA者157例。由我院产前诊断系统获取病例的临床资料。①一般资料：年龄、介入性产前诊断穿刺孕周、孕产史和临床诊断等。②相关检查资料：超声检查、CMA检测结果等。所有孕妇均接受检测前遗传咨询并签署《CMA检测知情同意书》，本研究已经过院伦理委员会审核同意（伦理审批号：202201124），并且已经取得患者的临床资料用于科学研究的知情同意书。纳入研究的TE胎儿根据是否合并其他系统异常，分为孤立性TE组（107例）和复杂性TE组（50例）2组，孤立性TE组孕妇年龄（28.29±4.41）岁，穿刺孕周（24.58±3.06）周；复杂性TE组孕妇年龄（29.37±4.58）岁，穿刺孕周（24.04±4.05）周，2组的年龄、穿刺孕周比较，差异无统计学意义（t分别为1.41和0.93，P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 标本采集根据孕周在超声定位下进行胎儿产前标本取材。孕16～24周的孕妇行羊膜腔穿刺取羊水30 mL，孕24周以后的孕妇行脐血穿刺取3 mL，行CMA检测。

1.2.2 CMA检测和CNV的判断采用美国Thermo Fisher Scientific公司CytoScan 750K芯片平台进行检测。胎儿样本DNA排除母源性污染后，按照标准试验操作进行实验，数据分析使用芯片平台配套的ChAS软件。CMA技术敏感度、分辨率高，可检出＞100 kb的CNV，无法检测染色体平衡易位、点突变等。分析过程参照本实验室内部数据库以及在线公共数据库，如DECIPHER，Databaseof Genomic Variants（DGV），Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM），UCSC Genome Browser，参照美国医学遗传学会（American College of Medical Genetics，ACMG）指南[2]对CNV进行判定。CNV分为五类：致病性CNV（pathogenic CNVs，pCNV）、可能致病CNV（likely pathogenic CNVs，lpCNV）、临床意义不明CNV（variants of uncertain clinical significance，VUS）、可能良性CNV（likely benign CNV）及良性CNV（benign CNV）。产前诊断CMA报告pCNV、lpCNV和符合实验室标准的VUS（缺失＞500 kb，重复＞1 Mb），而对于良性CNV、可能良性CNV和不符合报告标准的VUS不予报告。本研究将CMA检出的染色体变异分为染色体非整倍体和CNV两类，有临床意义的CNV包括lpCNV和pCNV。

1.2.3 胎儿TE有临床意义的CNV阳性率与低风险妊娠人群风险值比较根据文献[3]中高龄/焦虑孕妇妊娠的胎儿有临床意义的CNV发生率并不随年龄增长而升高及文献[4]胎儿产前超声异常孕妇相较于超声无异常者有临床意义CNV的发生率显著增高的结论，将高龄/焦虑孕妇、产前超声无异常妊娠人群定义为低风险妊娠人群，分别选取超声无异常妊娠人群和高龄/焦虑妊娠人群两个队列的有临床意义CNV的阳性率作为低风险妊娠人群的背景风险值。①超声无异常妊娠队列的背景风险值确定。本研究将Sagi-Dain等[5]无明显超声异常胎儿的CMA结果中有临床意义的CNV阳性率0.84%（47/5 541）作为超声无异常妊娠队列中有临床意义的CNV的背景风险值。②高龄/焦虑队列的背景风险值确定。本研究将文献荟萃中高龄/焦虑孕妇有临床意义的CNV阳性率0.84%（106/12 546）[6]确定为高龄/焦虑妊娠人群中有临床意义的CNV背景风险值。

1.3 统计学方法应用SPSS 19.0统计学软件对数据进行分析。定量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验；定性资料用频数/构成比（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CMA在TE胎儿中染色体变异检出情况本研究157例TE胎儿中，染色体变异阳性率为12.10%（19/157），非整倍体阳性率为5.73%（9/157），以21-三体、18-三体和性染色体非整倍体为主；CNV阳性率为6.37%（10/157），包括6例pCNV、1例lpCNV和3例VUS（临床资料见表1），有临床意义的CNV阳性率为4.46%（7/157），以微缺失/微重复综合征为主。孤立性TE组和复杂性TE组有临床意义的染色体变异阳性率、染色体非整倍体阳性率、有临床意义的CNV阳性率比较差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表1 CMA检出的10例CNV的TE胎儿的临床资料及分析结果

表2 CMA在TE胎儿检出有临床意义的染色体变异情况

2.2 TE胎儿中有临床意义的CNV阳性率与低风险妊娠人群背景风险值比较157例TE胎儿中有临床意义的CNV阳性率（16/157）显著高于超声无异常妊娠队列（47/5 541）和高龄/焦虑妊娠队列（106/12 546），差异均有统计学意义[OR=13.26，95%CI：7.34～23.96，χ2=121.881，P＜0.001；OR=13.32，95%CI：7.67～23.11，χ2=142.399，P＜0.001]。孤立性TE组有临床意义的CNV阳性率（5/107）显著高于超声无异常妊娠队列（47/5 541）[OR=5.73，95%CI：2.23～14.70，χ2=16.834，P＜0.001]和高龄/焦虑妊娠队列（106/12 546）[OR=5.75，95%CI：2.29～14.40，χ2=17.879，P=0.002]。复杂性TE组有临床意义的CNV阳性率（2/50）与超声无异常妊娠队列（47/5 541）[OR=4.87，95%CI：1.15～20.63，χ2=5.666，P=0.071]和高龄/焦虑妊娠队列（106/12 546）[OR=4.89，95%CI：1.17～20.38，χ2=5.832，P=0.068]比较，差异无统计学意义。

3 讨论

染色体微缺失/微重复是胎儿先天性畸形的重要遗传学病因，而CMA作为产前超声异常的首选临床遗传学分析工具，不仅可以检测染色体结构变异、染色体嵌合体（嵌合比例＞20%）和染色体纯合状态（absence of heterozygosity，AOH），还可以检测全基因组水平的CNV。

3.1 TE胎儿染色体非整倍体阳性率及其临床意义染色体非整倍体是胎儿TE的重要遗传学病因，本研究中染色体非整倍体阳性率为5.73%（9/157），以21-三体、18-三体和性染色体非整倍体为主，与既往文献报道基本一致。既往研究认为，胎儿复杂性TE与染色体非整倍体高度相关，复杂性TE需要介入性产前诊断排除非整倍体，而对于孤立性TE是否需要介入性产前诊断存在争议[7-8]。本研究中孤立性TE与复杂性TE组相比，染色体非整倍体阳性率差异无统计学意义，但均有较高的阳性率，因此，笔者认为，对于孤立性TE仍需要介入性产前诊断。

3.2 TE胎儿有临床意义的CNV阳性率及其临床意义本研究TE胎儿中CMA检出CNV阳性率为6.37%（10/157）。既往文献报道CNV是复杂性TE的重要病因[8]，有文献报道孤立性TE、复杂性TE组中检出有临床意义的CNV阳性率分别为3.06%（7/229）和5.00%（2/40）[9]。郭乔丽等[10]研究报道CMA在孤立性TE、复杂性TE组中有临床意义CNV的阳性率分别为5.26%（2/38）、26.67%（4/15），以上两项研究数据存在差异，但是复杂性TE组中有临床意义的CNV均高于孤立性TE组。本研究中孤立性TE组、复杂性TE组的有临床意义的CNV阳性率相近，分别为4.67%（5/107）和4.00%（2/50），差异无统计学意义（P＞0.05），因此对孤立性TE胎儿不能忽视CNV的检测。本研究与上述两项研究的数据存在差异，后续尚需联合多中心，积累大样本量临床数据，为产前遗传咨询提供参考依据。此外，对于携带CNV的TE胎儿，应验证CNV的遗传学来源，结合影像学检查以及双亲表型，为胎儿父母提供详细的遗传咨询，并对出生儿进行长期追踪随访。后续我们可以通过多中心合作不断积累数据，完善出生后病例的随访，建立本地人群CNV数据库，以便对携带CNV的胎儿评估积累临床证据。

3.3 TE胎儿相对低风险妊娠人群发生有临床意义CNV的风险既往有研究发现，胎儿有临床意义的CNV发生率不随年龄增长而升高，CMA检测不应局限于35岁或以上[3，11]。本研究提示TE胎儿发生有临床意义的CNV阳性率（4.46%）显著高于低风险妊娠人群（0.84%），其中孤立性TE胎儿发生有临床意义的CNV阳性率显著高于低风险妊娠人群，而复杂性TE胎儿组发生有临床意义的CNV阳性率与低风险妊娠人群相比差异无统计学意义（P＞0.05），可能与本研究复杂性TE样本量偏小有关。此外，值得注意的是复杂性TE胎儿中有临床意义的CNV的阳性率（4.00%）约为低风险妊娠人群（0.84%）的5倍，因此认为对于TE胎儿，无论是否合并其他系统结构畸形，均要考虑发生CNV的高风险性。

3.4 本研究中检出有临床意义的CNV的TE病例的分析TE是一些常见的微缺失/微重复综合征的常见表型[12]，本研究有临床意义的CNV，4例（4/7）为微缺失/微重复综合征，以22q11.2微缺失综合征（22q11.2 deletion syndrome，22q11.2 DS）（3/7）最为常见，既往研究发现22q11.2 DS多与心脏畸形、腭裂和免疫系统功能低下等表型相关，目前普遍认为单倍剂量敏感基因T-box1转录因子（TBX1）缺失是22q11.2 DS的重要致病原因。本研究例1右侧TE，左侧脑室临界增宽（10 mm），例2双侧TE，例3右侧TE，CMA检测发现分 别 缺 失3.25 Mb、2.88 Mb和2.9 Mb，均 提 示 为22q11.2 DS。Homans等[13]研究显示22q11.2 DS患者中TE的发生率（3.3%，48/1 466）是普通人群（约1‰）的30倍，提示TE与22q11.2 DS具有极高相关性。目前仅检索到一篇文献报道TBX1缺失的新生小鼠的头枕骨软骨间加速矿化导致融合[14]，目前足内翻与22q11.2 DS相关性机制待进一步研究。

例4胎儿双侧TE，CMA检出16p13.11区段缺失1.5 Mb，CMA提示为16p13.11微缺失综合征，主要表现为颅面部异常，神经认知异常等，其表现度和外显率存在差异[15]，目前尚未见16p13.11缺失与TE相关的文献报道，该例可能为产前诊断中的偶然发现。例5双侧TE，双肾盂分离，羊水过多，检出Xp22.31缺失1.7 Mb，该缺失包含STS基因，涉及X染色体性连锁鱼鳞病，再发风险高，目前尚无研究提示该基因与肢体解剖结构畸形相关，为产前诊断中的意外发现。例6右侧TE，羊水过少，CMA结果发现14q24.3-q32.33重复29.9 Mb，可导致14q三体综合征，主要表现为智力低下、发育迟缓和特殊面容等先天异常。例7双侧TE，CMA检出5q31.1区域发生2.7 Mb缺失，遗传自母亲，该区段包含的PITX1基因，属于同源异型结构域蛋白转录因子家族，主要在胚胎中胚层分化后半期表达，参与下肢发育。有研究提示PITX1变异或缺失致使膝盖以下的肌肉和骨骼量减少[16]。另有动物研究提示小鼠PITX1与小鼠足内翻样表型高度有关[17]，其具体致病机制还在进一步研究中。目前研究提示TE与染色体非整倍体、CNV相关外，基因变异也是TE的重要遗传学病因[18]，因此对核型分析和CMA均阴性的TE胎儿进行基因检测有助于明确病因。

综上所述，TE胎儿有临床意义的CNV发生风险显著高于低风险妊娠人群，染色体非整倍体和CNV是产前TE重要的遗传学病因，CMA技术在TE胎儿中可以提高约6%（10/157）的CNV检出率，CMA在检测TE胎儿染色体微缺失/微重复具有重要的临床价值。