弓形虫感染对小鼠睾丸间质细胞睾酮分泌的影响及机制研究

王海论，黄晓宇，余春辰，殷光文，王登峰，王 磊，黄志坚

(福建农林大学 动物科学学院(蜂学学院)/福建省动物药物工程实验室，福建福州 350002)

刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)是一种能感染几乎所有温血动物的细胞内寄生原虫，主要侵入脑部、眼、胎盘和睾丸等组织器官[1-2]。多数情况呈隐性感染，在免疫力低下时，可引发多种疾病，母畜怀孕后可能发生流产、产死胎和畸形胎，并将弓形虫传给下一代[3]。雄性动物感染可发生性功能下降、生殖系统损伤、精子数量减少或畸形等严重后果[4]。睾酮是由睾丸间质细胞分泌产生的，在精子成熟、刺激生殖器生长和维持性功能等方面具有重要作用[5]。多数研究表明，弓形虫急性感染能造成动物血清中睾酮含量的改变，但关于弓形虫感染影响睾酮分泌机制的研究较少。

睾丸间质细胞是产生和分泌睾酮的主要细胞[6]，以睾丸间质细胞为对象开展弓形虫影响雄性生殖障碍的相关研究具有重要意义。下丘脑-垂体-性腺轴是调控睾酮合成的经典途径，垂体释放的黄体生成素(luteinizing hormone,LH)与睾丸间质细胞上的LH受体结合后启动睾酮的合成，体外试验中通常使用人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)来代替LH来刺激睾丸间质细胞分泌睾酮[7]。胆固醇在LH的作用下迅速被动员，在类固醇激素合成相关酶的作用下生成睾酮，其中类固醇合成急性调节蛋白(StAR)、3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)、P450侧链裂解酶(CYP11A1)和P450侧链切割酶 17α(CYP17A1)是此过程中影响睾酮分泌的关键酶[8-9]，睾酮合成过程中这些酶含量的改变会影响睾酮的生成。

本研究以小鼠睾丸间质细胞瘤细胞(murine Leydig tumor cell line-1，MLTC-1)为细胞系，构建体外弓形虫共培养体系，探索弓形虫体外感染对小鼠睾丸间质细胞分泌睾酮的影响，为进一步探究弓形虫对雄性动物睾酮分泌提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 虫株与细胞 弓形虫速殖子(RH株)由中国农业大学索勋教授惠赠，小鼠睾丸间质细胞瘤细胞MLTC-1细胞由本实验室液氮保存。

1.1.2 主要试剂 RPMI-1640培养基、胰蛋白酶，美国Gibco公司产品；胎牛血清，美国 ZETA Life公司产品；瑞氏-吉姆萨染色液，武汉赛维尔生物科技有限公司产品；Percoll，北京索莱宝科技有限公司产品；睾酮检测试剂盒，中国北京北方生物技术有限公司产品；全蛋白提取试剂盒，江苏凯基生物技术股份有限公司产品；Anti-StAR antibody、Anti-CYP11A1 antibody、Anti-Cytochrome P450 17A1 antibody和Anti-Beta Actin antibody，杭州华安生物技术有限公司产品；HSD3B2 Antibody ，Affinity Biosciences公司产品；BCA 蛋白测定试剂盒、HRP标记的山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG，均为北京全式金生物技术有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 Infinite M200 Pro多功能酶标仪，帝肯(上海)贸易有限公司产品；DYY-10C型电泳仪，北京六一生物科技有限公司产品；LS-CO150 CO2培养箱，赛默飞世尔科技公司产品；尼康Ti数码倒置荧光显微镜，上海恒浩仪器公司产品；HFsafe-1200LC生物安全柜，上海力申科学仪器有限公司产品；Azure Imager多功能分子成像系统，深圳恩科生物科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 RH株速殖子纯化 37℃、5% CO2环境下，使用含100 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培养液培养MLTC-1细胞，24 h后将复苏的弓形虫RH株速殖子加入到MLTC-1细胞中培养，经96 h后90%以上的细胞破裂，用1 mL注射器反复吹打使细胞充分破裂，将细胞碎屑与弓形虫离心后，用40% Percoll分离液重悬，3 000 r/min离心10 min，收集沉淀，PBS清洗两次后获得纯化的弓形虫速殖子。

1.2.2 弓形虫处理MLTC-1细胞浓度与时间的筛选 于24孔板中按5×104个/孔的数量加入MLTC-1细胞，培养24 h，细胞换液后，加入含1 IU/mL hCG和弓形虫的培养液，弓形虫与细胞比例为0∶1(对照组)、1∶5、1∶1、5∶1、10∶1和20∶1，共6组，每组3个复孔，培养6 h，收集细胞上清。同样，加入含1 IU/mL hCG和弓形虫的培养液，以弓形虫与细胞比例为20∶1分别与MLTC-1细胞共培养3 h、6 h、9 h和12 h，共4组，每组内设对照组与感染组，收集细胞及上清。

1.2.3 显微镜观察 以虫体与细胞比例为20∶1分别与MLTC-1细胞共培养0 h、0.5 h、1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、48 h、60 h和72 h，瑞氏-吉姆萨染色，显微镜观察共培养情况。

1.2.4 ELISA检测细胞上清睾酮浓度 收集细胞上清，将其稀释50倍后，按睾酮检测试剂盒说明书操作，检测收集的细胞上清液中的睾酮浓度。

1.2.5 Western blot检测睾酮分泌相关蛋白的表达 按照全蛋白提取试剂盒说明提取细胞全蛋白，使用BCA试剂盒测定蛋白含量。蛋白变性后按20 μg/孔上样，进行SDS-PAGE 电泳，利用半干式转膜仪将蛋白转移到PVDF膜上，50 g/L脱脂奶粉室温封闭2 h，一抗(StAR抗体，1∶1 000稀释；3β-HSD抗体，1∶1000稀释；CYP11A1抗体，1∶1 000稀释；CYP17A1抗体，1∶500稀释；β-actin抗体，1∶1 000稀释)孵育过夜，TBST洗涤4次，5 min/次，二抗(HRP标记山羊抗鼠IgG，1∶3000稀释；HRP标记山羊抗兔IgG，1∶3 000稀释)室温孵育1h，同样用TBST洗涤后，ECL发光液显色，拍照分析结果。

1.2.6 统计分析 使用SPSS 25.0软件对试验数据进行统计学分析，n≥3，P<0.05 表示差异显著。利用GraphPad Prism 8软件绘图。

2 结果

2.1 弓形虫感染MLTC-1细胞浓度的筛选

弓形虫和MLTC-1细胞在不同比例下共培养6h后，收集的细胞上清使用ELISA检测其睾酮浓度。结果如图1所示，随弓形虫与细胞比例的增加，睾酮分泌量也逐渐增加，低感染比例下睾酮分泌量变化不明显。弓形虫与细胞比例高于5∶1时，弓形虫感染的组睾酮分泌量显著高于未感染组，即0∶1组(P<0.05)。

a～c.不同字母表示各组间差异显著，P<0.05。a-c.Different letters represent significant difference,P<0.05.图1 弓形虫与MLTC-1细胞在不同比例下共培养6 h的睾酮分泌水平Fig.1 Testosterone secretion levels of Toxoplasma gondii and MLTC-1cells cocultured with different ratios for 6 h

2.2 弓形虫感染MLTC-1细胞时间的筛选

ELISA检测弓形虫与细胞比例为20∶1共培养3 h、6 h、9 h和12 h的上清睾酮浓度，结果如图2所示，睾丸间质细胞睾酮的分泌量随弓形虫处理处理时间的延长而增加，并且感染组在各时间段的睾酮分泌量显著高于对照组(P<0.05)。

a～c.不同字母表示各组间差异显著，P<0.05。a-c.Different letters represent significant difference,P<0.05.图2 不同时间段下弓形虫感染MLTC-1细胞的睾酮分泌水平 Fig.2 Testosterone secretion levels in MLTC-1 cells infected with Toxoplasma gondii for different time periods

2.3 弓形虫感染后MLTC-1细胞状态的观察

通过瑞氏-吉姆萨染色后，观察弓形虫与细胞比例为20∶1情况下弓形虫入侵MLTC-1细胞过程，如图3所示，共培养0.5 h，弓形虫开始接近MLTC-1细胞；1 h时大量弓形虫接近MLTC-1细胞；3 h时大部分弓形虫进入细胞；12 h时细胞中出现大量空泡，随弓形虫入侵时间延长，空泡逐渐增加，60 h时细胞大量破裂。

弓形虫与细胞比例为20∶1。0 h～3 h.弓形虫逐渐接近MLTC-1细胞；3 h～12 h.弓形虫进入细胞；12 h～48 h.空泡逐渐增加；48 h～72 h.细胞逐渐破裂。箭头所示：3 h.游离的速殖子；12 h.细胞内速殖子；24 h.胞内空泡；72 h.破裂的细胞。The Toxoplasma gondii to cell ratio was 20∶1.0 h-3 h.Toxoplasma gondii gradually approached MLTC-1 cells;3 h-12 h.Toxoplasma gondii into the cells;12 h-48 h.vacuoles increased gradually;48 h-72 h.the cells broken gradually.Arrow:3 h.Free tachyzoite;12 h.Intracellular tachyzoites;24 h.Vacuole;72 h.Ruptured cells图3 弓形虫在MLTC-1细胞中的入侵和增殖过程(瑞氏-吉姆萨染色，×400)Fig.3 Invasion and proliferation processes of Toxoplasma gondii in MLTC-1cells (Swiss Giemsa staining,× 400)

2.4 弓形虫感染对MLTC-1细胞睾酮分泌相关酶的影响

Western blot结果显示，弓形虫与细胞比例为20∶1，感染组与对照组的StAR蛋白表达变化不明显，共培养9 h时，感染组的CYP11A1和3β-HSD的蛋白相对表达水平显著下降，且12 h时CYP17A1的蛋白相对表达水平也显著下降(P<0.05)，见图4、5。

图4 弓形虫感染对MLTC-1细胞睾酮合成相关酶蛋白的免疫印迹结果Fig.4 Results of Western blot for proteins involved in testosterone synthesis in MLTC-1 cells infected with Toxoplasma gondii

A.CYP171在不同时间下的相对表达量；B.3β-HSD在不同时间下的相对表达量；C.CYP11A1在不同时间下的相对表达量；D.StAR 在不同时间下的相对表达量。A.Relative expression of CYP171 at different times;B.Relative expression of 3β-HSD at different times;C.Relative expression of CYP11A1 at different times;D.Relative expression of StAR at different times.图5 ImageJ统计学分析弓形虫感染对MLTC-1细胞睾酮合成相关酶蛋白的免疫印迹结果Fig.5 ImageJ statistical analysis results of Western blot for proteins involved in testosterone synthesis in MLTC-1 cells infected withToxoplasma gondii

3 讨论

睾酮是维持雄性第二性特征和促进精子发育成熟的重要性激素[10]。因此，睾酮的分泌量对雄性的生育能力至关重要。Lim A[11]等研究发现，弓形虫感染能促进大鼠睾丸类固醇生成从而促进睾酮的合成，并推测这可能引起感染弓形虫的雄性大鼠减少对猫的恐惧并提升对异性的吸引力，利于弓形虫的传播。姜楠[12]等研究发现，弓形虫感染雄性小鼠后，小鼠血清中的睾酮含量先升高后降低。本试验将弓形虫与小鼠睾丸间质细胞进行共培养，持续观察弓形虫与睾丸间质细胞的状态。结果发现，共培养1 h，大量弓形虫开始接近MLTC-1细胞，3 h时大部分弓形虫进入细胞，数量明显增多，12 h时细胞中出现大量小泡，60 h时细胞局部大量破裂，说明弓形虫可在短时间内进入细胞并引起病变。Jones TC[15]等同样发现弓形虫能迅速入侵细胞并导致细胞病变。

胆固醇作为睾丸间质细胞合成睾酮的重要原料，在类固醇激素合成酶的催化作用下，转变为睾酮[18-19]。胆固醇在StAR酶的作用下，从线粒体膜外转运到线粒体内膜上，在内膜中，CYP11A1酶催化胆固醇裂解侧链，将胆固醇转变为孕烯醇酮进入内质网，并由不同酶催化转变为相应的类固醇激素。孕烯醇酮在3β-HSD的催化下转变为孕酮发生在滑面内质网上，未成熟的睾丸间质细胞不分泌睾酮，是因为产生的孕酮主要被CYP17A1催化转变为雄烯二酮，发育成成熟的睾丸间质细胞后开始分泌睾酮，是由于雄烯二酮在17β-HSD的催化下转变为睾酮，此时合成的睾酮立即被释放到细胞外[20]，因此可通过细胞上清来检测睾酮分泌。本试验通过Western blot检测睾酮合成分泌过程中相关蛋白和酶的表达后发现，共培养9 h时，感染组的CYP11A1和3β-HSD的蛋白相对表达水平显著下降，且12 h时CYP17A1的蛋白相对表达水平也显著下降(P<0.05)。有研究发现，与类固醇激素合成有关的核受体，对睾酮的合成和分泌有直接而广泛的调节作用[21]，因此推测，弓形虫可能通过影响类固醇激素合成相关核受体的表达影响睾丸间质细胞分泌睾酮，后续还需进一步研究。

本试验发现弓形虫能在短时间内进入小鼠睾丸间质细胞，并刺激睾酮分泌，但随感染时间的延长，弓形虫会抑制类固醇激素合成相关酶的表达，抑制细胞的正常功能。