牛活体采卵研究进展及其应用前景

蓝康澍，田 欣，蓝昕蕊，王勇胜

(西北农林科技大学 动物医学院，陕西杨凌 712100)

活体采卵(ovum pick-up，OPU)是指通过非手术的方式，在对供体影响最小的情况下采集母畜体内卵子的方法。因其能与体外受精、胚胎移植等技术结合提高育种效率和促进育种进程而受到广泛关注。OPU常与体外受精技术结合，但OPU所获得卵母细胞数量少一直都是难以突破的难关，近几年研究都注重提高卵母细胞的培养和发育效率，而注重于OPU本身效率提高的研究鲜有报道。虽然与传统的取卵技术如手术法采卵等相比，具有效率高、对供体影响小等优势，但OPU技术仍处于摸索阶段，在技术、操作上仍存在问题，若想通过OPU获取大量的优质卵母细胞，必然要克服这些问题。本文对近年来牛OPU的发展历程、活体采卵方法、影响因素和应用前景进行综述，旨在为OPU技术的进一步完善提供理论基础。

1 活体采卵技术发展历程

活体采卵最早是一种用于应对人类不孕症，采集人类卵巢内卵母细胞的微创性技术，Steptoe在1967年首次用该项技术采集到人类的卵母细胞，并在后续的研究中，在此技术的基础上，加以应用，成功获得了世界上第一个试管婴儿[1]。由于其突出的优势(微创，且可以获得较多的卵母细胞)，这项技术逐渐应用于家畜繁殖上，用于优良性状的保存和传递、培育高繁殖力动物种群。1983年，加拿大研究人员首次将内窥镜运用于活体采卵，对50头小母牛进行了总共129次内窥镜检查[2]。该技术在1987年于丹麦首次于超声波技术结合，效果良好[3]。在国外，内窥镜技术及超声波技术较早运用于活体采卵，而对于盲采法鲜有报道。在国内有较早关于盲采法的介绍，多采用自制采卵器进行活体采卵，后逐渐也被内窥镜采卵法及超声波采卵法所代替，其中超声波采卵法是活体采卵主要的方法[4]。

随着牛繁殖技术的发展，如何提高活体采卵的效率一直备受人们关注。许多研究都从不同层面探索提高活体采卵技术效率的方法。随着重视程度的提高，近几年活体采卵技术发展迅速，已逐步达到成熟稳定的阶段。

2 活体采卵方法

活体采卵主要是通过超声波仪器或内窥镜引导对供体母牛卵巢上的卵泡进行穿刺抽取卵泡液从而获得卵母细胞的技术，在进行活体采卵程序之前，需要对动物进行直肠粪便清理以及麻醉(相关程序可参考Cavalieri F L B等[5]的研究)，以助于后续采卵程序的进行。过去卵母细胞的获得方法都是从屠宰场的卵巢中获取，该方法由于所获得卵母细胞来源未知而无法满足一些育种繁殖实验的要求，而活体采卵技术的出现有效地解决了该问题。手术法采卵需要考虑多种因素如手术部位及操作手法等，操作不当很可能会引起子宫损伤和撕裂[6]。与手术法采卵相比，活体采卵技术对供体的伤害更小、重复性更高，能在更好地保护供体生产性能的前提下获得尽可能多的卵母细胞[7]。随着活体采卵技术的广泛应用以及生产需求，活体采卵技术不断发展，近年来取得较大进步。活体采卵方式主要包括以下几种。

2.1 盲采法

根据周木清等[8]所提供的方法，盲采法需要使用自制采卵器，操作人员用手在阴道部位感知卵巢表面卵泡所在部位，用采卵器(由采卵针、持针器、注射器、集卵杯和三通导管等组成)在阴道穹隆部位对卵巢卵泡进行穿刺，再用负压将卵泡液及卵子一同吸取，将卵母细胞收集后在实验室进行后续相关的筛选和分级操作。

盲采法需要操作者用手感知卵泡的部位，方法直观但只能感受到有限的、体积较大而容易被感知的卵泡，这也造成了通过盲采法所获得的卵母细胞数要比直接从屠宰场的牛卵巢获得的卵母细胞数量要少的结果。根据周木清等[8]的研究，屠宰场卵巢卵母细胞采集结果为平均每对卵巢可获得卵3.55枚，采卵数高于盲采法活体采卵(平均每头牛可获卵3.3枚)。

图1 盲采法活体采卵模式图Fig.1 Pattern diagram of blind ovum pick-up method

换而言之，盲采法更依赖操作者的经验，采集的结果受许多主观因素影响而不稳定。同时，由于对卵巢的穿刺位置仅凭感官定位，盲采法对供体的伤害也比较大，从而延长了可采卵的时间间隔、降低了采卵频率[9]，种种原因都导致现如今盲采法的使用受到限制。

目前对于以上盲采法的缺陷尚无较完善的解决方案。使用自制简易采卵器进行盲采法的卢晟盛等[10]建议在进行穿刺时直接刺穿卵泡而不是沿着卵巢皮质穿刺卵泡，并在采卵后给供体注射抗菌素，这样虽然会造成盲采法对卵子的低回收率，但可以较好地解决盲采法对卵巢伤害大、采卵间隔长、采卵频率低等问题。

盲采法对设备及手术条件的要求较低，故有较大的推广潜力，但现在仍没有有效的方法解决其对供体生殖器官伤害大的问题，同时盲采法对操作人员要求较高，若想进一步增强其实用性及普及性，可以增强对操作人员的培训，并且后续可以将提高盲采法对卵子的回收率作为切入点进行完善研究。

2.2 内窥镜或腹腔镜采卵法

内窥镜或腹腔镜法(laparoscopic ovum pick-up，LOPU)相对盲采法而言有更高的准确率，内窥镜和腹腔镜的使用也使得卵巢表面的卵泡能够被更直观地观察到，因此能在更准确、高效收集卵母细胞的同时减少对卵巢的伤害。该技术被证明是具有一定安全性的，且不会影响供体后续的繁殖活动与功能[11]。内窥镜采卵法在性成熟前的牛上已经与体外胚胎生产技术(invitroembryo production，IVEP)结合，目前已达到商业水平，具有较好的发展前景[11]。此外，也有关于将LOPU用于濒危物种保护的报道，说明了该方法不仅在动物生产上扮演重要角色，在动物保护上也同等重要[12]。

常用内窥镜活体采卵需要经过采卵前准备、穿刺和采卵三个步骤，在进行麻醉后向供体牛腹腔内充入二氧化碳(增大腹腔体积便于操作)，再使用内窥镜活体采卵仪进行穿刺。操作者一手在直肠内隔着肠壁固定住一侧卵巢，另一只手持仪器从阴道进入，在阴道穹窿处插入腹腔。直肠内的手将卵巢拉至内窥镜前端，通过内窥镜显示屏观察卵巢，不断调整内窥镜与卵巢之间的位置以观察卵巢表面形态、确定需要进行穿刺卵泡后对卵泡进行穿刺，之后同样使用负压吸取卵泡内的卵泡液及卵子。该方法仍对供体牛卵巢和阴道穹隆伤害较大，可能还会影响卵母细胞的质量以及供体牛的健康状况[13]。

李继成等[13]对原有内窥镜活体采卵法做以下改进：用细套筒将穿刺棒送入阴道穹窿，减小了对阴道穹窿损伤；穿刺后替换成粗套筒，加大了采卵视野面；不注入二氧化碳。这些改进旨在减少对卵巢及阴道的损伤、减少二氧化碳的消耗及提高采卵的准确性。为减少采卵前准备麻醉并发症(如食物返流)的产生，Baldassarre H[11]提出在内窥镜采卵前进行一定时间的禁食禁饮(干草、谷物和水分别至少禁36 h、24 h和12 h)。

内窥镜采卵法除了可以像超声波采卵法一样将设备从供体阴道进入完成后续采卵程序外，在个体较小、不便于在阴道进行操作的犊牛或小反刍动物上还可以选择从腹腔进入，将动物麻醉后采取仰卧、尾高头低位，于腹部作3个切口，使用腹腔镜、套管针、无创抓钳和光源等设备进行采卵。

总体来说，内窥镜活体采卵可以更直观、准确地对卵泡进行穿刺，虽然不可避免地会对阴道产生损伤，但相比其他方法，内窥镜法对卵巢和阴道的损伤相对较小。然而，由于设备复杂，操作繁琐，该方法的使用还是受到很大限制。

图2 内窥镜活体采卵模式图Fig.2 Pattern diagram of laparoscopic ovum pick-up method

2.3 超声波法

由于盲采法的低准确性以及内窥镜的操作复杂性，人们对新型活体采卵方法的需求越来越高，这就使超声波法活体采卵应运而生。由于具有采卵率高、对卵巢伤害小和采卵间隔时间短等优点[14]，超声波法已逐渐成为活体采卵的主要方式。目前在牛上，超声波法采卵与体外受精结合，已广泛用于牛的胚胎生产[15]。

超声波法主要是利用卵泡和卵巢其他组织对高频声波的吸收和反射能力不同，在荧屏上显示卵巢横截面图像，操作者可以根据显示的超声图像进行准确穿刺。在准备好仪器、对供体牛进行直肠粪便清除、硬膜外麻醉等术前准备后，操作人员一手持B超探头轻缓插入阴道穹窿处，另一手在直肠内透过肠壁对卵巢进行操作，方便探头观察卵巢，通过超声屏幕对卵泡进行观察，将需要进行穿刺的卵泡置于显示屏取卵线上进行穿刺取卵，吸取卵母细胞及卵泡液程序与前两种方法相同。许红喜等[16]在进行卵母细胞吸取时，建议应先启动真空泵再进行穿刺以防止卵母细胞流失。

黄右军等[17]应用B型超声波采卵法对42头母水牛进行采卵，共穿刺卵泡762个，实际收回513枚卵母细胞，回收率可达67.3%。建议在对卵母细胞进行吸取时负压不宜过大，否则会损害所吸取卵母细胞的卵丘细胞层，不利于卵母细胞的后续培养。D'Angelo A等[18]在2019年发表的论文中详细介绍了超声波法采卵，除了提出了采卵过程中的操作建议，文章还详细地介绍了如何进行活体采卵的术后护理如检查是否出现腹腔内出血以及监测动物意识、呼吸频率等。

超声波法采卵对供体牛的伤害最小，且恢复时间快，采卵频率也相应较高，但超声设备昂贵，且对操作人员要求高，距离其进一步的普及使用仍有一段距离。

图3 超声波活体采卵模式图Fig.3 Pattern diagram of ultrasound-guided ovum pick-up method

3 活体采卵影响因素

通过对活体采卵主要方法的了解，可见活体采卵技术发展已取得较大进步，已经可以代替手术法成为更成熟的卵母细胞采取方式。但是活体采卵的卵母细胞回收成果还具有较大的波动性，除受操作人员熟练程度影响，还有许多因素在活体采卵过程中起着十分重要的作用。这些因素可以影响活体采卵的频率、卵母细胞回收率等，故弄清这些作用因素以及明确其与活体采卵的关系，有助于进一步提高活体采卵的效率，使其得到更为广泛的应用。

3.1 连续采卵间隔影响

无论是哪种活体采卵方法，都会对供体牛的阴道和卵巢产生一定的伤害，这些伤害需要一定时间的恢复，如果无视伤害恢复时间而高频率进行采卵必然会对供体造成较大影响，高频率的穿刺甚至会引起卵巢的囊肿[19]。同时，由于牛卵巢的卵泡储备有限，高频率采集可能会导致收集到的卵母细胞质量较前几次收集的低。有研究表明不同的采卵时间间隔所得的卵母细胞不同，陈明棠等[20]对供体进行连续10个月的采卵，间隔3 d～27 d不等，结果表明大部分母牛卵巢在经过连续35次采卵后有明显损伤，在质地上也变硬和粘连，回收效果大体呈下降趋势。但并非采卵频率越高采卵的效果就越差，姚顺等[21]认为，在对卵巢卵泡进行采卵后约3 d后会形成优势卵泡，此时若不对卵巢进行采卵，优势卵泡就会通过控制促卵泡素(follicle-stimulating hormone，FSH)的合成和分泌来引起劣势卵泡的萎缩闭锁，从而使能采集到的卵母细胞数量减少。

表1 3种活体采卵方法优缺点对比Table 1 Comparison of advantages and disadvantages of three ovum pick-up methods

但是活体采卵的最短时间间隔仍需要进一步探索，以在对供体伤害较小的情况下取得尽可能多的卵母细胞。所以在对供体进行活体采卵时，除需要进行正确的操作外还要合理安排采卵时间和选择适宜的采卵频率，在进行一定次数的连续采卵后给予供体充分的时间恢复，最大限度减少对供体卵巢的伤害，防止卵巢出现粘连、硬化和囊肿等影响后续采卵的并发症。

3.2 外源激素及其他化学物质影响

最早的OPU程序中不包含激素刺激，仅定期在每周进行2次采卵，但在将所有可见卵泡进行抽吸时未见有优势卵泡发育[22]。向供体注射促性腺激素、促性腺激素释放激素等有利于卵泡的形成和发育，Sakaguchi K等[23]已证实促性腺激素释放激素可以提高水牛活体采卵所获得卵母细胞数量和胚胎生产力，且多次注射FSH中的最后一次注射与活体采卵的时间间隔影响卵母细胞的发育能力，但单次注射FSH与采卵的最佳时间间隔还有待研究[24]。最佳的激素处理方案仍需要进一步探索。除此之外，还有报道称小母牛血浆中的抗苗勒氏管激素水平与卵泡数量正向关，是除直肠检查外评估排卵数和胚胎数的可靠指标[25]。

上述激素虽然与卵泡发育相关、可以促进卵泡发育，但仍存在许多问题。赵善江等[26]的研究表明，诸多因素如血液循环对激素的消耗等都会影响供体对FSH的反应。梁金旺等[27]表明孕马血清促性腺激素(Permanent magnet synchronous generator，PMSG)半衰期长，在供体体内不易被清除，容易影响后续卵泡的发育和成熟。各类激素的合理有效使用条件仍需不断摸索。

除各类激素外，还有许多外源化学物质可以应用于活体采卵。李宁等[28]证明，在母牛饲粮中加入β-胡萝卜素可以促进促黄体素(luteinizing hormone，LH)分泌，进而促进卵泡发育。相比直接注射激素效果更可控，可以避免出现激素使用过多而因为半衰期较长而影响后续卵泡发育等问题。

在进行活体采卵前进行必要的激素处理可以一定程度地提高卵母细胞质量和胚胎生产力。但由于激素在体内的消耗以及代谢需要一定的时间，剂量过大会由于激素长时间发挥作用而干扰供体本身的繁殖周期以及繁殖活动，所以要合理安排处理剂量以及频率。

3.3 采卵年龄段影响

不同年龄段的牛生殖系统发育情况不同，其产生卵泡的能力也不同。青年母牛虽然体格发育已经成熟，但其乳腺及生殖器官还尚未发育完全，故经产母牛相较于青年母牛而言更适合被选为超排供体。并且与成年母牛的卵母细胞相比，小牛的卵母细胞发育能力非常差[29]。Baldassarre H等[30]的研究也证明从大于130日龄的荷斯坦奶牛上获得的胚胎发育到囊胚期的数量(19.9%±6%)要比小于100日龄的荷斯坦奶牛的(9.5%±8%)多。但并非年龄越大效果越好，随着母牛年龄增大，其生殖功能也相应退化，Currin L等[31]表明母牛到达一定年龄后，供体牛所能提供的平均卵母细胞数量随着年龄增加而下降。

目前采卵的最佳年龄段仍在摸索，选取原则也有待研究。青年母牛虽然生殖器官尚未发育成熟，卵泡的生成能力较弱，但其卵母细胞的体外受精率、胚胎体外发育率都要高于成年奶牛[32]。虽然随着母牛年龄的增大，所能获取的平均卵母细胞数下降，但卵母细胞的囊胚率却增加[31]。王腾飞等[33]选取3头13月龄～15月龄营养状况良好且无疾病的青年母牛进行相关试验，结果表明，虽然获得的可用卵母细胞数差异不显著，但供体牛之间的体外受精囊胚率差异显著(囊胚率分别为54.7%±15.8%、32.9%±11.1%和12.4%±2.0%)。

活体采卵的年龄段不但可以影响所能获取的卵母细胞数量，还可以影响卵母细胞质量进而影响活体采卵的后续实验。在进行活体采卵时也需要选取合适年龄段的母牛进行采卵，综合母牛生殖机能发育情况等因素，以提高卵母细胞采集数量。

3.4 其他因素

除以上主要因素外，活体采卵的效果还受其他因素影响。采卵时需要使用负压吸取卵泡液和卵母细胞，此时负压过大会破坏卵母细胞的卵丘细胞层，进而影响到后续试验的效果[17]。Gutiérrez-Aez JC等[34]的研究表明在6月～8月进行采卵能获得更多卵母细胞。此前许多人疑惑的关于牛的品种组成是否影响采卵效果，Monteiro CAS等[35]关于荷斯坦奶牛和瘤牛杂交品种的研究也给出了否定的回答，Mointeiro猜测原因可能是杂交个体仍能保留原有主要品种的特征。

控制好采卵的各类条件，有利于使采卵的效果趋向稳定和高效，可以提高活体采卵的效率，有助于活体采卵技术的进一步推广。

4 活体采卵技术的应用前景

活体采卵技术最早是为人类不孕症而建立的收集人类卵母细胞的辅助生殖方法，后逐步应用于牛，显著提高了牛的生殖效率，不仅可以获得更多优质的卵母细胞，并且还可以确定卵母细胞的来源，达到母牛优良性状的高效遗传。活体采卵具有微创性、可重复性和可靠性等特点，可以在对供体几乎不产生损伤的条件下收集优质的卵母细胞，且无需考虑供体的繁殖状态[22]，适用范围广，具有广泛的应用前景。牛的活体采卵为体外胚胎生产和体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer，SCNT)等技术提供了良好的材料[12]。还有研究表明内窥镜采卵法所得的卵母细胞已经成功用于体细胞核移植克隆程序的受体细胞质、用于显微注射的合子以及用于转基因和基因组编辑动物的生产[11]。OPU与超数排卵和胚胎移植技术(multiple ovulation and embryo transfer，MOET)相比具有显著优势。OPU与MOET的目的都是从优良雌性个体中产生更多后代，但是MOET的结果差异较大，且会干扰供体的正常生殖和生产周期，缺乏稳定性与可靠性。此外，活体采卵还有用于卵巢囊性综合征或类似疾病治疗的潜能[22]。OPU技术也可用于科学研究，OPU可以干扰卵泡的动力学，可以辅助人们进一步了解卵泡的发展进程及相关调控机制，为将来与卵泡相关技术应用提供理论基础。

5 展望

活体采卵可以对特定的母牛进行活体采卵，为卵核移植、基因工程、胚胎工程等技术提供了优质的实验材料。实现活体采卵技术的进一步完善和推广，是使繁殖育种技术更上一层楼的重点突破口。随着内窥镜、超声波等技术设备的引入，活体采卵的准确性大大提高，对供体的伤害性也大幅度降低，但仍有很多方面需要进一步提高。在技术上，无论是内窥镜法还是超声波法都要求操作人员能够熟练操作仪器设备。在仪器设备方面，超声波等仪器的高昂价格使得该技术的使用受到限制。此外，在采卵过程中控制好各类影响因素如供体牛的年龄段、采卵前的激素处理、采卵的频率和进行采卵的季节等，也是获得较好采卵效果的关键。

本文对现阶段活体采卵遇到的主要问题以及影响活体采卵效果的主要因素进行综述，为活体采卵技术的改良以及发展提供便利，旨在为繁殖育种进程提供参考。