龙胆苦苷对CCl4 诱导的肝纤维化模型大鼠保护作用及机制研究

黄燕，余淑贞，于小华，黎忠良，饶品德，曹娟，汤小林

（江西省儿童医院，南昌 330006）

肝纤维化是由慢性非自限性肝损伤产生的一种以细胞外基质过量沉积为特征的损伤修复反应[1]。过度纤维化可导致肝硬化、肝癌的发生，预防或及时逆转肝纤维化进展是保护肝脏的重要策略[2-3]。中医理论认为肝脏多“阳常有余阴常不足”，肝病机理多属“体阴而阴不足”，治疗方面，传统中医药在抗肝纤维化方面展示了其独特优势[4-5]。

龙胆草是传统医学治疗肝脏疾病的常用药物，性寒，具泻肝胆实火、清热除燥等功效[4]。其主要活性成分龙胆苦苷是一种活性较强的裂环烯醚萜类物质[5]。据报道龙胆苦苷具有逆转肝损伤、治疗酒精性肝炎及肝内胆汁淤积等药理活性，但药理机制尚未明确，多认为与抑制炎症、抗氧化等有关[6-8]。基于此，本研究拟构建肝纤维化大鼠模型，探讨龙胆苦苷对肝功能、肝纤维化的保护作用及其机制，为龙胆苦苷的进一步应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂 清洁级SD 大鼠，雄性，180 g～220 g，购自南昌大学动物实验中心。龙胆苦苷(含量＞95%) 购自南京道斯夫生物科技公司，批号：181116A。四氯化碳（99%）购自国药集团化学试剂公司。丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）及丙二醛（MDA）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；转化生长因子-β(TGF-β)、透明质酸（HA）及胶原蛋白-III（COL III）检测试剂盒购自武汉博士德生物公司；谷氨酰转肽酶(GGT)、羟脯氨酸（Hyp）、超氧化物歧化酶（SOD）均购自Sigma 公司。

1.2 主要仪器 7020 型全自动生化分析仪（日本日立）、BT125D 电子分析天平（德国赛多利斯）、CX-31 光学显微镜（日本OLYMPUS）、UV-2550 紫外分光光度计（日本岛津）、FSH-2A 高速组织匀浆机（华城润华）、低温高速离心机(美国赛默飞)。

1.3 实验分组及处理 选取60 只SD 大鼠，适应性饲养一周，随机均分为对照组、模型组、干预组，各20 只。模型组大鼠每隔一天腹腔注射15% CCL4的油溶液（剂量：0.80 mL/kg），首剂量加倍。干预组大鼠腹腔注射CCL4的油溶液后，给予灌胃服用60 mg/kg 剂量龙胆苦苷。对照组大鼠给予等剂量PBS腹腔注射。三组大鼠分组处理8 周，常规饲养。

1.4 观察指标

1.4.1 肝组织外观观察 实验大鼠处死后，迅速剖腹，将完整的肝脏取出后仔细观察，主要包括肝脏外观形态、色泽变化、组织弹性，及是否出现明显病变等。

1.4.2 血清中AST、ALT、ALB、GGT 含量测定 分组处理后大鼠心脏穿刺取血3 mL，离心后取血清，使用全自动生化分析仪分析血清中ALT、AST、ALB、GGT 含量，具体操作依据设备使用说明。

1.4.3 血清中TGF-β1、HA、COL III 含量测定 取大鼠血清，依据TGF-β1、HA、COL III 检测试剂盒步骤处理样本，于450 nm 波长处测定吸光度，换算得到TGF-β1、HA 及COL III 值。

1.4.4 肝组织匀浆MDA、SOD 和Hyp 含量测定大鼠分组处理后取定量肝右叶组织，置生理盐水中漂洗干净，精密吸取3 mL 低渗盐水（浓度：0.86%）加入烧杯，快速将肝右叶组织剪碎，使用高速组织匀浆机匀浆，用低温离心机离心处理分离上清液，按照试剂盒步骤处理样品，于特定波长处进行测定，计算肝组织匀浆中MDA、SOD 和Hyp含量。

1.5 统计方法 用SPSS 22.0 统计学软件处理数据，计量资料以()表示，组间比较用t 检验，P＜0.05 表示有显著性差异。

2 结果

2.1 大鼠肝组织形态观察 观察各组大鼠肝组织形态，对照组大鼠肝组织呈均匀暗红色，表面有光泽，形态正常，组织富有弹性。模型组大鼠肝组织呈灰黄色，颜色不均匀，欠光滑，且有局部白色斑块，偏硬。干预组大鼠肝组织颜色不均，整体呈现红色，色泽和弹性均好于模型组，但较干预组仍较差。

2.2 大鼠肝功能指标情况 比较各组大鼠分组处理后肝功能指标情况，模型组和干预组大鼠血清AST、ALT、ALP、GGT 均明显高于对照组（P 均＜0.05）；干预组大鼠血清AST、ALT、ALP、GGT 均明显低于模型组（P 均＜0.05），见表1。

表1 大鼠血清肝功能指标比较()

表1 大鼠血清肝功能指标比较()

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

2.3 大鼠肝纤维化指标情况 比较大鼠分组处理后血清肝纤维化指标水平，模型组和干预组大鼠血清TGF-β1、HA、COL III 均明显高于对照组（P均＜0.05）；干预组大鼠血清TGF-β1、HA、COL III均明显低于模型组（P 均＜0.05），见表2。

表2 大鼠血清肝纤维化指标比较()

表2 大鼠血清肝纤维化指标比较()

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

2.4 大鼠肝氧化应激指标情况 比较大鼠分组处理后肝组织匀浆氧化应激指标水平，模型组和干预组大鼠MDA 和Hyp 均高于对照组，SOD 低于对照组（P 均＜0.05）。干预组大鼠MDA 和Hyp 均低于模型组，SOD 高于模型组（P 均＜0.05），见表3。

表3 大鼠肝组织匀浆氧化应激指标比较()

表3 大鼠肝组织匀浆氧化应激指标比较()

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

3 讨论

肝纤维化是组织损伤的自我修复反应，也是多种慢性肝病的重要病理特征和进展过程[9]。早期肝纤维化是可逆的，也是预防慢性肝病进展为肝硬化的关键策略，中医则以气虚和血瘀的证候表现为辨证要点[10]。龙胆草归肝、胆经，具有泻肝胆火、清热燥湿作用，也是多种肝胆方剂的主药。多研究表明其主要成分龙胆苦苷具有逆转肝损伤、治疗肝炎作用，但作用机制有待明确[11]。

本研究经CCL4诱导构建大鼠肝纤维化模型，肝组织观察可见明显异常，提示已发生病理病变；血清肝功能指标AST、ALT、ALP、GGT均明显增高，表明CCL4会明显影响肝功能。AST 多在肝细胞线粒体内分布、ALT 主要存在于肝细胞浆中，当肝细胞受损或坏死时，AST、ALT、ALP、GGT 的含量可灵敏反映肝细胞受损情况[12-13]。给予龙胆苦苷则可以明显缓解CCL4诱导的肝组织病变及血清指标变化，提示具有抗肝功能损伤作用。

肝细胞受损时细胞外基质中胶原代谢异常、纤维结缔组织增生并形成了纤维化[14]。本研究大鼠经CCL4诱导血清TGF-β1、HA、COL III 水平均显著提高，表明发生肝纤维化病变。TGF-β1 是肝纤维化关键细胞因子，可经多途径刺激肝星状细胞活化促进肝纤维化；HA 可反映肝内生成纤维量及受损情况；COL III 水则是纤维化重要基质[15-16]。因此TGF-β1、HA、COL III 水平可反应肝纤维化进展情况。研究显示龙胆苦苷可明显抑制TGF-β1、HA、COL III 的升高，表明可明显缓解CCL4诱导引起的肝纤维化水平。

肝纤维化的诱发及影响因素复杂，高水平的氧化应激在肝纤维化进展中有重要作用，可刺激成纤维细胞和肝星状细胞，促进胶原的合成及沉积，加速肝纤维化的进程；因此抗氧化损伤是逆转肝纤维化的一个研究热点[17]。研究表明，龙胆苦苷具有一定抗氧化应激活性，可降低脓毒血症模型小鼠肝组织一氧化氮水平，并诱导髓过氧化物酶活性发挥护肝作用[18]。在爆发性肝损伤模型小鼠中也可缓解谷胱甘肽含量的降低，并改善过氧化水平[19]。本研究中，龙胆苦苷可明显缓解CCL4诱导引起的肝组织MDA 和Hyp 水平增高，及SOD 的降低，表明龙胆苦苷具有明显的抗氧化应激作用。这与已有研究一致，可能是保护肝功能、抗纤维化活性的一个重要机理。

综上，本研究明确龙胆苦苷具有肝保护作用，能抑制肝纤维化进展，可能与抗氧化应激损伤有关，明确机制有待进一步研究。