WT1 基因在骨髓增生异常综合征中的表达及与疗效的关系

孙万磊，陈娟娟，吴琼，贺文凤，邹叶青，刘川

（南昌大学第二附属医院检验科，南昌 330006）

骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）是一组起源于造血干细胞的异质性克隆性疾病，其生物学特征是髓系细胞（粒系、红系、巨核系）一系或多系发育异常（或称病态造血）和无效造血，高风险向急性髓系白血病（AML）转化，约20%～30%的MDS 病例转变为AML[1-2]。WT1 基因作为Wilms 肿瘤的易感基因，不仅与实体肿瘤的发生、发展密切相关，同时也在血液恶性肿瘤中有着高表达[3-4]。WT1 基因的过表达与不成熟的造血细胞有关[5]，WT1 表达水平随着MDS 患者疾病阶段的进展，其表达水平是MDS 患者评估病情、预测病情变化及判断预后的重要指标。本研究通过定量PCR 检测MDS 患者WT1 基因表达水平，探讨WT1 表达与MDS 患者在诊断分型及疗效评价中的意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2015 年11 月至2021 年12 月于南昌大学第二附属医院诊断的MDS 患者共70 例，男43 例，女27 例，年龄35～78 岁，中位年龄62岁。根据世界卫生组织（WHO）2016 年MDS 分型标准对其进行分类，其中MDS-SLD 3 例，MDSMLD 25 例，MDS-EB 42 例（其中EB-1 共19 例，EB-2 共23 例）。同时并根据修定的国际预后积分系统(IRSS-R)对MDS 患者进行危险度的分层，极低危组3 例，低危组18 例，中危组24 例，高危组14 例，极高危11 例。34 例MDS-EB 患者接受包括去甲基化药物（如阿扎胞苷、地西他滨）单药、或联合维奈克拉及小剂量化疗、HAG 或CAG 方案等治疗。阴性对照组为45 例非恶性血液系统疾病患者的骨髓样本。

1.2 实验方法（1）提取RNA 及逆转录：骨髓穿刺时收集初诊及治疗后的MDS 患者骨髓3～5 mL，用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，经淋巴细胞分离液（Ficoll 分离液）分离单个核细胞。经TRIzol 法（Invitrogen 公司）提取骨髓单个核细胞总RNA，紫外分光光度仪测定260、280 nm 吸光度，计算RNA含量及纯度。取2 μg 总RNA 用MMLV 逆转录酶逆转为cDNA。（2）实时定量聚合酶链反应（RQPCR）：使用ABI 7500（ABI 公司，美国）荧光定量PCR 仪进行RQ-PCR 检测。WT1 基因及ABL 内参基因的引物及TaqMan 探针序列见表1。PCR 反应体系共20 μL: Premia Ex TaqTM 10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，荧光探针0.8 μL，cDNA 模版2 μL，灭菌去离子水6.2 μL。反应条件为：50 ℃预变性3 分钟，95 ℃热启动5 分钟，然后95 ℃变性20 s，60 ℃退火60 s，共45 个循环。每次实验均设立阴性及阳性对照。（3）WT1 表达计算方法：以ABL 为内参照基因，用已知拷贝的ABL 标准品进行PCR 扩增，制作标准曲线，分别计算各样本中WT1 及ABL 基因的拷贝数，WT1 基因表达水平（%）=（W1 拷贝数/ABL 拷贝数）×100%。

表1 WT1、ABL 基因引物及探针

1.3 统计学处理 采用SPSS 23.0 统计软件进行统计处理，计量资料以()表示，均采用非参数检验，Kruskal-Wallis 检验进行组间两两比较，两组间比较用秩和检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 WT1 基因在MDS 患者中的表达 不同诊断分型的MDS 患者，WT1 表达水平存在一定差异，MDS-SLD 及MLD 组WT1 表达水平较低，与对照组无显著差异(P＞0.05)，而MDS-EB-1 及MDSEB-2 组，WT1 表达水平较对照组、SLD 及MLD 组显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05),而EB 1 及EB 2 组之间的WT1 表达水平并无显著统计学差异(P＞0.05)，见表2。

表2 WT1 在MDS 分型中的表达

2.2 不同IPSS-R 危险分层MDS 患者WT1 表达按IPSS-R 积分系统进行预后分层，MDS 患者可分为极低危组、低危组、中危组、高危组及极高危组。结果发现，对照组、极低危组、低危组及中危组MDS 患者的WT1 表达水平均无显著统计学差异(P＞0.05)，而高危组及极高危组MDS 患者，WT1 表达水平显著高于其它组(P＜0.05)，而高危组及极高危组之间WT1 表达无显著差异(P＞0.05)，见表3。

表3 WT1 在不同预后分层MDS 患者中的表达

2.3 MDSRAEB 患者治疗前后WT1 表达水平比较34 例MDS-EB 患者接受了包括去甲基化药物单药或联合维奈克拉、小剂量化疗等方案化疗，化疗后复查WT1 基因表达，发现治疗前34 例MDS-EB患者WT1 基因表达为（8.21±6.3）%，治疗后WT1表达水平下降为（0.73±0.56）%，与治疗前相比，差异有显著统计学差异(P＜0.05)。

3 讨论

骨髓增生异常综合征作为一组异质性疾病，部分患者存在向急性髓细胞白血病转化风险[6-7]，在疾病的不同阶段需密切进行观察以判断其危险度、疗效及预后。通过准确的预后评估，为不同危险度的患者选择最适宜的治疗方案显得尤为重要。在MDS 患者风险及预后的评估标准中，原始细胞比例、血细胞减少的程度和细胞遗传学特征等是主要指标[8-9]。文献报道染色体核型异常在MDS的检出率为40%～70%，在幼稚细胞数不高的MDS患者中伴有异常核型尚不足32%[10]。对于该部分缺乏染色体核型分析结果病人来说，更需要有力的指标以协助患者进行诊断、判断预后及指导治疗。

WT1 基因被称为“泛白血病基因”，在急性白血病中表达显著增高，WT1 基因的表达水平被证实与原始细胞的总量相关，其表达水平的高低可用于血液系统恶性肿瘤的进展、预后及检测微小残留病（MRD）的检测指标[11-12]。在本研究发现非恶性血液病患者低水平表达WT1 基因，而WT1 基因在不同分型的MDS 患者中的表达存在显著差异，在WHO(2016) MDS 分型标准中，原始细胞是一个重要指标，原始细胞比例小于5%时，诊断为SLD或MLD，而这两组MDS 患者的WT1 表达水平较低，与对照组相比无显著差异；当MDS 患者的原始细胞比例大于等于5%时，患者诊断为MDS-EB-1，而原始细胞比例为10%～20%时，诊断为MDSEB-2。结果发现，MDS-EB-1 及EB-2 患者的WT1基因表达水平显著高于对照组、SLD 及MLD 组，但EB-1 及EB-2 之间并无显著统计学差异。此外，按IPSS-R 分层体系对MDS 患者进行危险分层，发现极低危组、低危组与中危组的WT1 表达与对照组无显著统计学差异，而高危组及极高危组的MDS患者的WT1 表达水平显著高于极低危组、低危组与中危组。此研究结果说明，MDS 患者的WT1 表达水平与原始细胞比例及危险分层有关。

本研究中，MDS-EB 患者接受了以去甲基化药物为基础的方案治疗，治疗后患者的WT1 水平显著下降,在疾病监测过程中发现，部分患者在病情复发进展时WT1 水平再次显著升高（结果未展示），说明WT1 表达与治疗效果存在相关性。多个研究发现，MDS 患者去甲基化治疗及造血干细胞移植过程中，可通过监测WT1 基因的表达水平以评估其疗效，并预测患者的总体生存期、无进展生存期[13-15]。因此，在MDS 患者的诊治过程，可通过定期监测WT1 的表达，对疾病治疗疗效、复发及进展等进行评估。

总之，在MDS 患者的诊治过程中，WT1 基因的表达水平监测具有重要意义，不仅可作为其危险度评分的依据，同时也可作为其治疗效果的监测指标。本研究例数相对少，需要更多病例及规范监测时间来验证及支持。