NQO1对膀胱癌的生物学特性和预后的影响

矫宾宾，丁振山，黄 涛，徐 鑫，张 冠*

（1.首都医科大学附属北京朝阳医院泌尿外科，北京 100020；2.中日友好医院泌尿外科，北京 100029）

在我们前期研究中，基于肿瘤微环境中ROS（活性氧）响应型纳米载药体系在膀胱癌的治疗中取得了较好的疗效[1]，为进一步探究提升ROS 的水平是否造成肿瘤组织和正常组织中ROS 水平的差异，通过查阅相关文献我们发现ROS 的产生与基因NQO1（NAD（P）H quinone oxidoreductase 1）的表达密切相关[2～5]。在后期研究中，我们拟通过激活NQO1 提高膀胱癌组织中ROS 水平。NQO1 在膀胱癌中的表达与预后的关系、及其在膀胱癌中的生物学信息尚未阐明，本文就NQO1在膀胱癌中的详细分子生物信息学特性展开研究，为后续进一步利用其调控ROS 产生的能力设计制备级联放大效应的ROS 响应性纳米药物在膀胱癌灌注化疗中的应用奠定基础。

1 资料与方法

1.1 数据收集获取

本研究从The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据库（https：//cancergenome.nih.ov/，2022-02-03）下载了433 个BLCA 样本的mRNA 测序数据，其中19 个样本是正常样本。并同时下载了相关临床数据。本研究的全过程都遵守了TCGA 数据库的相关准则和政策。

1.2 差异表达和富集分析

通过选取肿瘤组织与正常组织样本做关于NQO1的差异表达，同时通过配对信息，做肿瘤组与正常组的配对差异分析。对比NQO1的表达差异。

根据NQO1 的表达情况，由高到低排列，选取NQO1 表达的中间值为截断点，分为高表达组和低表达组。对两组进行差异分析，通过得到的差异基因进一步行富集分析。

1.3 相关分析

Cox 回归模型log-rank 检验比较高、低表达组膀胱癌患者的总生存期（OS），通过预测网站对比无疾病进展生存期（DFS）有无差异，并计算风险比（hazard ratio，HR）。分析NQO1 与临床相关信息（年龄、TNM、stage分期）的相关性等。

通过TIMER 软件做NQO1与免疫细胞标记物及免疫细胞的共表达分析，分析NQO1 在膀胱癌中与免疫浸润的关系。

1.4 统计学方法

应用统计软件R 语言（4.0.3 版本）进行数据统计分析。采用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线并通过Log-rank检验分析。

2 结果

2.1 NQO1基因在正常膀胱及膀胱癌组织中的表达

通过TCGA 膀胱癌mRNA 的数据，我们共得到433个样本信息。其中肿瘤样本424个，正常组织样本19个。通过样本名称匹配，我们得到的19个正常样本为肿瘤样本中肿瘤的癌旁正常组织，可以行配对差异分析。NQO1 基因在膀胱癌组织中的表达与对应的正常膀胱组织比较，NQO1 基因在膀胱癌组织中的表达显著降低，无论是配对对比还是肿瘤样本与正常组织样本对比，均差异有统计学意义，即NQO1 在肿瘤组织样本中存在过表达现象。（图1）。

图1 A.肿瘤样本与正常组织对比；B.配对样本肿瘤组与癌旁正常组织的对比

2.2 差异分析和功能富集结果

以NQO1的表达量分为高低表达，2组进一步做差异分析和功能富集，NQO1 编码蛋白主要定位于细胞核，分子生物学功能主要为酶和蛋白结合，生物学过程主要为信号调控。而相关信号通路主要富集于癌症相关信号通路如细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路等。如图2所示。

图2 以NQO1表达量分为高低2组后，差异基因的功能富集分析

2.3 NQO1的表达与临床信息的相关性分析

我们分别就与年龄、TNM、分期做了进一步分析，发现NQO1与上述无明显统计学相关。如图3所示。

图3 NQO1的表达与临床信息的相关性

在与预后相关性的研究中，我们基于TCGA发现其表达与总体生存期无明显相关性。通过网站分析工具（http：//gepia2.cancer-pku.cn/#index）结合TCGA 及GTX 数据库，在疾病无进展生存期方面，NQO1 与预后有明显相关性，并对相关临床因素做了独立风险因素分析，NQO1 非影响膀胱癌总体生存期的独立风险因素。需要额外说明的是，因为此网站分析工具是基于TCGA 及GTX 数据库，所以部分数据可能与TCGA 实时数据库的信息有少许出入，如图4所示。

图4 A.NQO1高低表达2组在膀胱癌中总体生存期的比较；B.NQO1高低表达2组在肿瘤无进展生存期中的比较

2.4 NQO1在膀胱癌中的表达与免疫浸润的关系

通过线上工具TIMER，我们发现NQO1 的表达与部分免疫细胞存在相关性，如B 细胞（正相关），CD8+T 细胞（负相关），CD4+T 细胞（负相关），与巨噬细胞以及中性粒细胞无明显相关性；我们进一步探究了NQO1 在膀胱癌中的表达与免疫细胞标记物的共表达分析，我们发现NQO1的表达与大多数各类免疫细胞的标记物存在共表达相关性。具体如下,B 细胞标记物：CD19（负相关），CD79A（负相关）；CD8+T 细胞：CD8A（负相关），CD8B（负相关）；CD4+T 细胞：CD4（负相关）；巨噬细胞：NOS2（负相关），IRF5（正相关），PTGS2（负相关）；中性粒细胞：CEACAM8（负相关），ITGAM（负相关），CCR7（负相关）。如图5、图6所示。

图5 NQO1表达与免疫细胞的关系

图6 NQO1表达与免疫细胞标记物的关系

3 讨论

在我们前期研究中，我们通过设计ROS 响应型的纳米载药体系，在膀胱癌灌注化疗中取得了较好的疗效，但我们发现仅仅依靠膀胱癌肿瘤组织中自有的较高的ROS 水平来实现肿瘤组织和正常组织的ROS 水平的差异依然相对不足。所以，我们希望通过进一步提高肿瘤组织中的ROS水平扩大与正常组织的差异来实现ROS 响应性药物对肿瘤组织的高选择性杀伤。通过查阅相关文献，我们发现NQO1 与ROS 的产生密切相关。NQO1 是一种黄素蛋白，作为同型二聚体发挥作用，与FAD 结合的每个单体都会催化多种醌的强制性双电子还原为它们的氢醌形式，会消耗细胞辅助因子NADH或NADPH[6]。这些对氢醌的形式通常非常不稳定，会自发与氧气反应，并转化回母体醌。这种无效循环会导致显著的NAD（P）H 氧化并产生ROS，包括最终导致过氧化氢（H2O2）形成的超氧化物。H2O2的产生会产生氧化应激并促进细胞死亡[7]。基于此，我们希望通过选择合适的方法进一步扩大肿瘤组织与正常组织二者之间ROS 水平的差值，增大药物的治疗窗口，实现级联放大效应。NQO1 底物如兰雪醌、β-拉帕酮（LAPA）、丹参酮IIA 可通过NQO1 介导的氧化还原循环触发过量的ROS 形成诱导癌细胞凋亡，并已成为一种有前途的选择性抗癌疗法[8]。有研究指出，在PEG-PMAN 嵌段共聚物胶束中共包封LAPA 和ROS响应前药BDOX，有效地建立了级联放大药物释放系统[9]。但LAPA 存在药代动力学弱、生物利用度有限、水溶性差、半衰期短、需要给药系统等障碍[10～12]。仍需寻找更为合适的NQO1底物。

NQO1 是一类通常在真核细胞中表达的黄素蛋白酶。它通过电子还原反应积极参与各种醌的代谢及其体内生物活化[13]。与正常细胞相比，NQO1 的表达水平在许多实体瘤细胞中高度上调。相对于正常组织样本，NQO1 水平在多种癌症类型中表达水平显著增加，如肺癌、结肠直肠癌和乳腺癌等[14～16]。NQO1 因其在肿瘤中的过表达和生物活性而被认为是候选分子靶标。但NQO1在膀胱癌中的表达情况及生物信息学特性尚未有过较为全面的探究，本文的研究结果为后续实验奠定理论基础。

目前对肿瘤微环境相对于正常组织的成分差异目前已成为智能纳米药物的介入点。所以，目标成分在肿瘤组织和正常组织中的显著差异是产生响应以提高靶向性的前提基础。在本研究中，通过TCGA 下载的膀胱癌的表达矩阵，无论从肿瘤样本与正常样本的常规对比，还是配对对比，均发现NQO1 在肿瘤标本与正常标本之间存在差异性表达，这为ROS 响应性纳米药物基于NQO1 的差异表达在膀胱癌中的应用提供了前提条件，也是本研究关注的主要研究结果。但目前的肿瘤微环境和正常组织中的差异是否足以产生有效的刺激响应有待于进一步实验探究。

在临床及预后的相关性研究中，我们发现NQO1 的表达与疾病无进展生存期存在相关性，但与总体生存期无显著相关性。同时，对于与临床信息如TNM 分期及分级相关性方面，NQO1 的表达与其无明显相关性。这可能对设计的纳米药物提出挑战，是否注重应用NQO1 本身的对膀胱癌细胞的杀伤作用，还是着重对NQO1 本身产生ROS 进行重点设计，需要进一步权衡。NQO1 对疾病的进展相关，且NQO1 的高表达对应更差的疾病进展，基于此，是否可以设计一款针对NQO1的纳米药物，抑制NQO1 的表达，延缓疾病进展，提高预后效果。

目前肿瘤微环境的概念逐渐成为研究热点，免疫浸润和肿瘤微环境对各种肿瘤发生、发展起重要作用，肿瘤分子特征和免疫微环境的动态相互作用可产生不同临床结果。本研究显示，NQO1与膀胱癌浸润B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞显著相关，即NQO1 的表达水平与免疫标志物CD19、CD79A、CD8A、CD8B、CD4、NOS2、IRF5、PTGS2、CEACAM8、ITGAM、CCR7 等显著相关，表明NQO1 在肿瘤免疫浸润细胞中具有重要调节作用，可能与肿瘤免疫逃逸有关。这为后续我们制备纳米载药体系是否可以联合免疫治疗提供一个新思路。

虽然我们在本研究中，对NQO1 在膀胱癌中的生物信息学作用做了比较详细的研究，但在应用实际临床样本进行验证尚缺部分数据，其次，对于NQO1 与肿瘤的重要预后指标理论上无明显相关性，这对后期的纳米药物设计的功能偏重方向提出挑战。

综上所述，本研究对于NQO1 在膀胱癌中的生物信息学作用进行了较为详细的阐述，基于NQO1 导致ROS 水平在肿瘤和正常组织的差异，设计制备ROS响应性的纳米药物可行性较高。