改良的荧光标记菊粉清除率检测法在糖尿病小鼠肾损伤评估中的应用

刘 琳，姜世敏，张浩军，李 鸿，杨 悦，卓 莉，李文歌

（1.中日友好医院肾病科，北京 100029；2.中日友好医院临床医学研究所，北京 100029）

菊粉是一种完全经肾小球自由滤过而不被肾小管重吸收，也不被肾小管分泌的惰性物质，是用于肾小球滤过率（glomerular filtration rate，GFR）检测的理想物质之一。然而由于小鼠血、尿标本有限、收集困难，传统方法菊粉清除率操作复杂，实验条件要求高[1，2]。近年来，Zhonghua Qi 等人报道了通过检测异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的菊粉（FITC-菊粉）荧光衰减速率反映GFR 的方法[5]，但其应用并未得到广泛开展，尤其国内几乎无人使用。本研究首先尝试改进该方法，希望为小鼠GFR 测定提供准确性高同时可行性强的方法。此外，db/db是先天性2 型糖尿病小鼠，目前尚缺少关于其GFR 变化的长期观察研究，因此本文在建立稳定方法后连续测定了db/db 小鼠在28 周龄内的GFR 变化，同时评估了其蛋白尿、肾脏病理等改变，为确证db/db小鼠作为糖尿病肾病肾小球高滤过状态研究的动物模型提供有益的尝试。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

FITC-菊粉（瑞典TDB 公司）、HEPES 缓冲液（pH 7.4）、一次性使用微量采血吸管（江苏康健华医疗用品有限公司）、肝素包被的1.5ml EP 管（江苏康健华医疗用品有限公司）

1.2 实验动物

SPF 级6 周龄雄性db/db 小鼠10 只及同窝雄性对照db/m 小鼠5 只，购买于南京模式动物研究所，实验动物质量合格证号：SCXK（苏）2018-0008，饲养于中日友好医院SPF 级动物房，适应性喂养2周后开始实验。血糖数据为禁食8h后检测的空腹血糖。

1.3 小鼠清醒状态下GFR的检测方法

0.9%生理盐水配制浓度为2.5%的FITC-菊粉，振荡器充分搅拌溶解后用0.22μm 滤器过滤，于4℃冰箱避光保存。检测前小鼠自由活动、自由饮食饮水，检测前10min 内将0.3ml 饮用水灌胃以避免检验过程中因摄入不足造成血容量减少而影响GFR。将上述配制好的FITC-菊粉以3.7μl/g体重的剂量对清醒小鼠进行內眦静脉丛匀速弹丸式注射，并计时为0 点。分别在注射后1、2、3、4、5、7、10、15、35、55、75min 使用一次性微量采血吸管于尾静脉采血5μl，装入肝素包被的EP 管避光保存。以3000r/min 离心后取上清（血浆）2μl，每个标本使用HEPES 缓冲液（pH 7.4）稀释至40μl（稀释20 倍）置于96 孔板中，于荧光酶标仪上检测荧光强度，激发波长485nm，吸收波长583nm。同时将配制的FITC-菊粉以1：200 稀释为40μl置于96孔板，设置3 个复孔，与血浆标本同时检测荧光强度后取平均值，计算1μl FITC-菊粉对应的荧光值。每个检测标本最终均以40μl 体积平铺于96孔板中进行检测，以避免体积对荧光读数的影响。

应用GRAPH Pad Prism 8.0 中的two-phase exponential decay 进行统计分析，通过公式GFR=I/（A/α+B/β）计算GFR。其中I 为所测试小鼠实际注射的FITC 菊粉所对应的荧光值，A 和B 是2 个衰减对应的y 轴截距，α 和β 是2 段曲线的衰减常数（在GRAPH Pad Prism 8.0 中称为Kfast、Kslow）。因FITC-菊粉在180min 以后血药浓度趋近于0，在“contrain”栏中将“plateau”设置为“constant equal to 0”。

1.4 非同日GFR重复性检测

使用上述GFR 检测方法，随机选取4 只db/db小鼠和4 只db/m 小鼠在非同日进行GFR 检测，作为该方法的重复性检测。

1.5 生化检验

在20 周龄、28 周龄随机选取db/db 小鼠5 只和db/m 小鼠5 只，使用代谢笼留取12h 尿液标本用于检测尿糖、尿微量白蛋白/肌酐。

1.6 小鼠肾组织病理检查

处死20 周龄、28 周龄db/db 小鼠和db/m 小鼠各5 只，肾脏标本固定于4%福尔马林后石蜡包埋，2μm切片后行PAS染色，光镜下观察。肾小球直径：每只小鼠的PAS 染色切片在光镜下随机选取10 个带血管极和（或）尿极的肾小球，测量经尿极和（或）血管极的直径记为肾小球直径，最后计算平均直径[6]。

1.7 统计学方法

同一标本2 次结果的对比采用配对t检验。2组小鼠不同时间点体重、血糖及GFR 的比较采用两因素重复测量方差分析，组间比较采用Mann-Whitney U 检验。连续变量采用均数±标准差表示。

2 结果

2.1 改良版小鼠FITC-菊粉清除率的计算过程解析及稳定性评估

在內眦静脉丛注射FITC-菊粉之后1、2、3、4、5、7、10、15、35、55、75min 的小鼠血浆稀释至40μl，实测荧光值减去空白对照平均荧光值（40μl HEPES 液所测得的荧光值，设置至少3 个复孔），再除以稀释倍数，得到该时间点每微升血浆产生的荧光值，该值随时间变化的曲线如图1所示，符合两室模型（two-phase exponential decay）。使用FITC-菊粉原液稀释200倍，取40μl检测荧光（设3 个复孔）用于计算每微升FITC-菊粉对应的荧光值，与注射的体积相乘得到小鼠注入的荧光总量I。以公式GFR=I/（A/α+B/β）计算GFR。

随机选取4 只db/db 小鼠和4 只db/m 小鼠在非同日进行GFR 检测，结果如图2 所示，2 次检测的GFR 一致性较好，虽均值略有差别，差异无统计学意义（配对t检验，P＞0.05）。因小鼠在清醒状态下尾静脉采血进行检测，且时间点有固定要求，容易因不能配合等因素造成某个时间点采血失败，因此本研究改良了文献报道的方法，增加了时间点设计以保证获得足够的GFR 有效数据。为了验证本方法的稳定性及可操作性，我们随机选取10次小鼠的GFR 检测数据，每次检测的全部数据中任意去掉1个时间点，观察缺少1个时间点对GFR 计算结果的影响。经GRAPH Pad Prism 8.0软件验证，缺少1 个时间点的数据所得的荧光衰减曲线符合两室模型，能够进行GFR 计算。如表1 所示，注射后1min 时间点的数据缺少使得GFR结果的偏差最大，平均达到31.0μl/min（范围1～130μl/min），与原始GFR 的差异具有统计学意义（P＜0.05）。注射后2min 数据缺少计算GFR 结果的偏差为11μl/min（范围3～24μl/min），但与原始GFR 相比差异仍具有统计学意义。从第3min 之后的数据缺少，对结果的影响差异均无统计学意义（P＞0.05），虽然15min 以后数据缺少所致GFR偏差达45～113μl/min，但主要发生在GFR＞1000μl/min 的检测中，＜1000μl/min 检测的差异仍然较小，无统计学意义（P＞0.05）。

图2 同一小鼠非同日检测GFR结果对比

表1 不同时间点缺少数据后的GFR数值（μl/min）

2.2 小鼠的血糖、体重及尿糖、尿蛋白变化

db/db 小鼠体型肥胖、毛色顺滑，活动量显著少于对照小鼠。图3示，观察组小鼠8周龄体重为42.5±4.9g，与正常对照组（22.9±1.5g）比较差异有统计学意义（P＜0.05），并且在8～28 周龄期间2 组差异均有统计学意义（P＜0.05），在28 周龄时体重达到最大值，为61.5±9.4g。db/db 小鼠在8 周时空腹血糖20.4±10.0mmol/L，与正常对照组（9.2±2.0mmol/L）比较差异有统计学意义（P＜0.05），血糖水平在28 周内基本保持稳定，2 组差异均有统计学意义（P＜0.05）。20 周龄和28 周龄db/db 小鼠的尿糖也显著高于对照组小鼠，差异有统计学意义（P＜0.05）。20 周龄时db/db 小鼠的尿微量白蛋白/肌酐为38.07±27.73mg/mmol Cr，显著高于对照小鼠0.04±0.01mg/mmol Cr（P=0.008）。28 周龄时db/db 小鼠的尿微量白蛋白/肌酐仍维持较高水平，为24.33±10.74mg/mmol Cr，显著高于对照小鼠（P=0.029）。

图3 db/db小鼠的体重和血糖变化

2.3 db/db小鼠GFR的变化

图4 示，db/db 小鼠的GFR 均值在8～20 周龄期间高于正常对照组，其中第16周龄和20周龄分别为851.1±235.2μl/min 和796.0±338.7μl/min，与同期正常对照组（440.5±182.1μl/min 和299.6±74μl/min）相比，差异有统计学意义（P＜0.05），2 组间均值的差值达到410.6μl/min 和496.4μl/min。从第24 周龄开始，GFR 下降至与对照组接近，提示db/db小鼠的肾小球高滤过期持续至20周龄。

图4 db/db小鼠的GFR动态变化

2.4 db/db小鼠肾脏病理改变

图5（见封二）示，20 周龄的db/db 小鼠的肾脏病理表现为肾小球肥大，肾小球平均直径为32.6±1.6μm，显著高于对照小鼠（25.0±0.9μm），差异有统计学意义（P=0.08）。28周龄的db/db小鼠不仅存在肾小球肥大，肾小球直径为31.6±1.7μm，仍然显著高于对照小鼠（26.4±1.4μm），差异有统计学意义（P=0.016），而且部分肾小球出现系膜基质增多（见图5C）。

图5 db/db小鼠和对照小鼠的肾脏病理表现及肾小球直径（PAS×100）

3 讨论

小鼠GFR 的检测受到其血、尿标本量少的限制，传统的GFR 检测方法如菊粉清除率、肌酐清除率等实施难度较大[1，2]，一些新型的检测方法如经皮小鼠GFR 检测方法[3]、近红外光荧光分析检测法[4]则需特殊仪器才能实现。国外文献报道的使用FITC 菊粉通过检测血浆中荧光衰减速率计算GFR 的方法具有一定优势[5，7]，并且在为数不多的几项研究中得到应用[8～10]，但是相关报道仍然较少，尤其在国内更未查到。可能的原因有：（1）既往的文章对该方法原理、操作过程及计算方法的描述欠清晰；（2）由于小鼠采血困难，在本文作者尝试的过程中，发现个别时间点如果采血不成功将导致本次GFR 检测整体失败，增加了实验难度。因此，我们仔细学习并复制该方法之后通过总结和改进，摸索出改良版的FITC-菊粉清除率测定方法，较原方法更为准确，并具有更好的可操作性。第1min 和第2min 的荧光数据缺失对检测的准确性影响最大，文中作了详细描述，供国内学者参考。

db/db 小鼠是一种先天性2 型糖尿病小鼠，也常被用于糖尿病肾病相关的研究[11，12]。本文观察到db/db 小鼠在28 周龄内肾脏损伤的变化，使用改良的FITC-菊粉清除率测定方法检测GFR 动态改变，同时观察20周龄和28周龄时尿蛋白水平和肾脏病理表现，证实db/db 小鼠在20 周龄以后出现肾小球高滤过、微量白蛋白尿以及肾小球肥大、系膜基质增多等糖尿病肾病的早期表现。

3.1 检测原理的解读

FITC-菊粉注射之后血浆荧光值随时间的变化曲线符合药代动力学中常用的两室模型（twophase exponential decay）。其中快速衰减相（分布相）血药浓度下降很快，主要源于2 个途径，一个是药物从血管内转移到血管外造成的血药浓度显著下降，另一个是机体代谢和排泄的消除；而慢速衰减相（消除相）曲线较为平坦，是因为药物在血管内外分布已达到平衡，仅有药物的代谢和排泄因素主要参与血药浓度的下降，菊粉在体内的代谢符合这一规律。曲线的横坐标为时间（tx），纵坐标为血浆中检测到的荧光强度（Y）。该模型的曲线函数是Y=Ae-αtx+Be-βtx+平台值。因在180min 后认为菊粉已经完全清除，血药浓度接近于0，故平台值是0，函数简化为Y=Ae-αtx+Be-βtx。GFR=I/（A/α+B/β），具体计算见方法部分。

3.2 静脉注射部位的选择

小鼠静脉注射的传统方式是尾静脉注射，但小鼠的尾静脉较细，穿刺失败率高，即使成功，因管径太细，注射时间较长，不能满足本研究弹丸式注射的要求。而且在清醒状态下，小鼠尾部不易固定，极易跑针，难以保证药物剂量。内眦静脉丛注射是近年来新兴的小鼠静脉注射方式，其优势是操作简便、成功率高、能够完成短时间大剂量注射，平均注射100μl 液体仅需1.49s，10 次注射的成功率能够达到100%[13]。本研究采用內眦静脉注射，在预实验充分练习注射后，正式实验注射成功率也接近100%。需要注意的操作要点是，充分固定小鼠头部，使眼球突出，于內眦区域斜行负压进针，刺入眼球后方，进针深度为2～3mm，避免伤及眼球，见回血时进行注射，注射完毕后迅速放开小鼠、解除头部的压力，避免药液及血液外流。

3.3 检测开始前增加灌胃步骤

因检测过程长达75min，小鼠因紧张等因素饮水进食量均较小，为避免有效循环血量改变对GFR的影响，增加饮用水灌胃步骤。此外，糖尿病小鼠对水的需求较高，测试开始前灌注饮用水可避免脱水等不良事件的发生。

3.4 荧光检测仪器和采血量的改进

文献中的荧光检测使用的是分光光度计，所需检测样本体积相对较大，且每次测量样本量有限。因本实验尝试使用的荧光酶标仪，精确度较高且样本的最小体积能够达到40μl，在预实验中小鼠血浆成倍稀释后荧光测定值的线性关系良好，故本实验将每次的采血量降低到5μl，以最大限度减少对循环血量的影响。此外，该仪器可使用96孔板检测，使得同时检测的样本量大大提升。

3.5 对检测时间点的改进

文献报道的采样时间大多为3、7、10、15、35、55 及75min 共7 个时间点[5]，但我们在预实验中发现仅有7 个时间点不能保证每只检测的小鼠得到符合两室模型曲线，有时GRAPH Pad Prism 8.0会出现“Ambiguous”字样。此时得到的参数计算结果误差很大，尤其当个别时间点采样失败时更易出现这种情况。因此，我们增加了检测时间点。由于在前几分钟内血浆荧光值衰减速率较快，因此为得到更准确的曲线，我们在前5min 内每min进行检测，将时间点增加至11个，所有曲线未再出现“Ambiguous”字样，且减少任意1 个时间点仍能得到合格曲线，除第1min和第2min的检测结果缺失会产生有统计学意义的差异，其他时间点某一个数据缺失对GFR 结果影响不大。此外，在非同日重复检测同一只小鼠的GFR，差异无统计学意义，提示该方法具有良好的操作性和可重复性。

3.6 db/db小鼠高滤过状态的观察

糖尿病肾病最早期的表现为肾小球高滤过，之后随着尿蛋白的增多，GFR逐渐下降，但国内缺少对糖尿病小鼠GFR 的观察。本文使用先天性2型糖尿病db/db 小鼠作为糖尿病小鼠模型，在28周龄内观察其GFR 的变化，为日后研究糖尿病肾病早期高滤过状态的机制打下基础。本文观察到从8 周龄开始，db/db 小鼠的GFR 均值虽高于对照组，但差异无统计学意义，到16 周龄和20 周龄，db/db 小鼠出现了具有统计学意义的高GFR 状态，同时，在20 周龄以后db/db 小鼠出现微量白蛋白尿和轻度的肾脏病理损伤，符合糖尿病肾病的早期表现。

综上所述，经过增加采血时间点、减少采血量、改进荧光检测方法、检测前增加饮用水灌胃步骤等措施改良的FITC-菊粉清除率测定是一种更为准确、稳定的检测清醒小鼠GFR 的方法，具有较高的应用价值。经过28周的观察，证实db/db小鼠在20 周龄以后出现肾小球高滤过、微量白蛋白尿以及肾小球肥大、系膜基质增多等病理损伤，该小鼠可作为研究糖尿病肾病早期的动物模型。