基于电热型扫描微镜的微型双光子显微镜探头设计

余小敏 张林嘉 罗文松 谢会开

1(成都信息工程大学电子工程学院物理场生物效应及仪器四川省高校重点实验室，成都 610225)2(北京理工大学信息与电子学院，北京 100081)

引言

双光子荧光显微成像技术最早在90年代初由美国康奈尔大学Denk 等实现[1]。 该技术利用双光子激发荧光进行三维显微成像，被认为是目前最适宜于活体光学显微成像的技术之一[2]，也成为在体无创脑光学成像的首选技术[3]。 但经典的双光子荧光显微镜体积大、重量重，无法微型化进行动物的在体试验，也限制其便携化用于运动状态下活体动物的研究。 因此，将探测部分微型化，形成微型双光子荧光显微镜探头已成为可行的解决方案。体积小、重量轻的微型探头可固定在小鼠头部，因此不会对小鼠日常生活造成影响，有助于在体试验。

为了实现探头微型化，可使用光纤导入激光，通过扫描系统和光学系统，聚焦激光至样品激发荧光，再采集荧光信号成像。 其中扫描系统设计是探头微型化的关键，很大程度上决定了显微镜探头尺寸和荧光成像质量。 目前有研究报道采用光纤端面振动扫描技术[4]，但是光纤端面扫描采样率低，且光纤振动容易引起运动伪影，荧光成像质量不理想。 另外就是采用微机电系统 ( micro electromechanical system，MEMS)精密加工技术，目前基于MEMS 的扫描微镜分为以下4 种技术。 1)静电微镜技术[5]采用镜面和电极之间的静电力使镜面产生旋转运动实现扫描，优点是速度快、功耗低，缺点是驱动电压大，难以实现大扫描角。 2)电磁技术[6]利用线圈中电流在磁场作用下产生洛伦兹力，驱使微镜运动，可以在低驱动电压下获得大扫描角和纵向位移，缺点是功耗大，磁铁或线圈的尺寸限制其小型化。 3)薄膜压电驱动扫描技术[7]，其驱动电压、功耗低，但是材料的磁滞特性、电荷泄露，以及材料成分成为其发展的挑战。 4)电热型微镜技术[8]，其利用支撑微镜的执行器中不同材料的热膨胀系数差异，实现微镜运动。 该技术缺点是功耗高，材料热响应慢，优点是驱动电压低，扫描范围大。 相比静电驱动技术，制造过程简单，成本低；比电磁驱动技术更易组装和小型化，也没有压电材料的滞后性和安全风险，非常适合体内检测或可穿戴式生物医学成像。

本研究分析电热型微镜的结构与受力，制作了电热型微镜并测试其性能；在此基础上，研制了微型双光子显微镜探头，并利用搭建的双光子显微荧光成像系统测试了显微镜探头的荧光图像分辨率，验证了基于电热型微镜的双光子荧光显微镜探头用于脑部神经活动研究的可行性。

1 材料与方法

双光子荧光显微镜探头结构如图1 中虚线部分所示，是由激发光系统和荧光采集系统组成。 激发光系统包括单模光纤、微镜、汇聚透镜、二向色镜和GRIN 透镜，荧光采集系统有聚合物光纤、耦合透镜，复用的二向色镜和GRIN 透镜。

图1 双光子显微镜探头系统框图Fig.1 System diagram of two photon microscopy probe

1.1 电热型微镜受力分析

电热型微镜的执行器为双层材料结构[9]，如图2(a)所示，由Al 和SiO2组成。 双层材料在应力失配条件下产生变形，应力失配包括在薄膜沉积或生长过程中产生的内部应力和在薄膜沉积或生长后产生的外部应力。 内应力可由腔室压力和气流波动、晶粒聚结、杂质掺入等多种因素引起，而外应力主要由外力、温度变化等引起。

双层材料薄膜在应力失配作用下，薄膜的倾斜角和尖端位移的几何关系如图2(b)，有

图2 双层材料薄膜受力的几何尺寸。 (a) 双层材料变形示意；(b) 几何参数Fig.2 Geometric illustration of a bimorph.(a)Deformation of a bimorph； (b) Parameters of a bimorph.

式中，θ是薄膜尖端的倾斜角，d是尖端位移，ρ0是材料变形曲率半径，Lb是双晶片长度，tAl和tSiO2分别是Al 和SiO2的厚度，βb是双层材料曲率系数。根据材料厚度和杨氏模量，计算双层材料曲率系数。Δε是材料的应力失配，包括内部应力失配Δεin和外部应力失配Δεex，如式(3):

将式(3)带入式(1)，得到倾斜角θ:

式中，θin为双层材料加工过程应力变形产生的初始倾斜角，ΔθJH是双层材料通过电流产生热量引起的角度变化，由式(5)表示:

式中，αAl和αSiO2分别是Al 和SiO2的热膨胀系数，ΔTJH是两种材料焦耳热引起的温度变化。 根据式(1)～(5)，可得到执行器通电后的尖端位移d。

1.2 电热型微镜制作

微镜的加工过程[9]如图3 所示。 步骤如下:(1)先对清洗后的高阻硅晶片正面采用等离子增强化学气相法(PECVD)沉积第一层1 μm 的SiO2，用湿法刻蚀形成执行器底层材料；(2)溅射一层0.2 μm 厚的Pt 并剥离作为加热电阻层[见图3(a)]；(3)沉积0.1 μm 厚的SiO2作为电绝缘层，再溅射1 μm 厚的Al 并剥离作为执行器的中间层[见图3(b)]；(4)用PECVD 沉积1.2 μm 的SiO2，使用反应离子刻蚀法(RIE)刻蚀成执行器上层材料[见图3(c)]；(5)随后溅射0.3 μm 的Al 金属膜，并采用剥离工艺形成微镜面[见图3(d)]；(6)为使双层材料和镜面下形成空腔，溅射一层200 nm 厚的Al2O3膜在晶片的背面，并通过湿法刻蚀形成图形；再通过深度反应离子刻蚀法(DRIE)和RIE 刻蚀掉背面的Si 和SiO2[见图3(e)]；(7)最后通过各向异性和各向同性DRIE 从晶片正面刻蚀去掉执行器下的硅[见图3(f)]。

图3 电热型微镜加工流程。 (a)二氧化硅和铂层图形；(b)铝薄膜层溅射和剥离；(c)二氧化硅等DRIE和RIE；(d)铝薄膜层溅射和剥离；(e)背面DRIE 和RIE；(f)正面各向异性和各向同性DRIEFig.3 Fabrication process of electrothermal MEMS mirror.(a) SiO2 and Pt patterning； (b) Sputter Al and lift-off； (c) PECVD SiO2 and RIE； (d) Sputter Al and lift-off； (e) Backside DRIE ＆ RIE； (f)Frontside anisotropic DRIE and isotropic DRIE

1.3 双光子荧光显微镜探头光学系统设计

探头内部光学系统设计如图4 所示。 图4(a)为激发光路，飞秒激光器(Chameleon Vision II，Coherent，美国)输出波长800 nm，经单模光纤(SM-920，Throlab，美国) 传输到探头内，光纤末端带GRIN 透镜准直，输出光斑直径0.5 mm。 微镜扫描范围为± 3.5°，输出激光以45°入射至微镜，经微镜反射后呈90° 偏转，再经非球面透镜(83606，Edmund，美国)汇聚，经过与光路呈45°放置的二向色镜(64466，Edmund，美国)再次反射。 二向色镜对560 nm 以上波段激光反射率达95 %，对560 nm 以下波段透过率为99.98 %。 汇聚后，激光传播至GRIN 透镜(64526，Edmund，美国)，该透镜直径1.8 mm，节距0.23，NA 为0.55，激光经GRIN 透镜聚焦作用于样品。 通过ZEMAX 光学软件进行仿真，设定探头工作距离1 mm，有效光学数值孔径NA为0.33，理论扫描范围为200 μm × 200 μm，横向分辨率达到1.48 μm。 图4(b)为荧光采集光路，样品产生的荧光经GRIN 透镜、二向色镜透射，再由球面透镜(47857，Edmund，美国)会聚至聚合物光纤(02551，Edmund，美国)，光纤直径2 mm，数值孔径NA 为0.5。

图4 显微探头光学设计。 (a)激发光路；(b)荧光光路Fig.4 TPMP optical design.(a) Excited laser optical design； (b) Fluorescence optical design

1.4 测试实验方法

1.4.1 电热型微镜性能测试

电热型微镜的性能包括准静态响应和动态频率响应。 准静态响应是同时对所有执行器施加相同电压测试其垂直位移。 在光学显微镜下，调整物镜至图像清晰，通过微定位记录仪(Quadra-Chek 200，Heidenhain，德国)分别记录镜面和镜架的位置，两者之差既是镜面相对镜架的距离。 每改变一次电压，记录下镜面位移。 动态频率响应是对所有执行器施加同一直流信号，同时施加差分交流信号，通过跟踪微镜反射的激光，测试不同模式下微镜运动的谐振频率响应曲线。

1.4.2 双光子荧光显微镜探头成像分辨率测试

为测试双光子荧光显微镜探头成像质量，对MEMS 微结构进行成像。 测试方法为把含有荧光试剂的凝胶加入微结构凹槽，采集凹槽的荧光图像。荧光试剂的配制采用荧光素粉末溶于乙醇，制成浓度为10 mg/mL 的荧光试剂；把0.2 mg 的琼脂粉加入10 mL 去离子水，加热到100℃至充分溶解形成琼脂凝胶；在琼脂凝胶尚未冷却凝固前把配好的2 mL荧光试剂加入琼脂凝胶中混合均匀，冷却后放入冰箱避光保存。 测试前取部分凝胶均匀涂抹在微结构上，用盖玻片压紧，使凝胶填满凹槽。

2 结果

2.1 电热型微镜性能

将电热型微镜置于光学显微镜(Olympus BX51，Olympus，日本)下观察，其整体外形和执行器局部结构如图5 所示。 微镜尺寸是1.4 mm×2 mm。

图5 微镜。 (a)光学显微镜下观察的微镜；(b)局部放大的双层材料执行器Fig.5 Micromirror.(a) SEM of the micromirror；(b) Zoom-in view of the inverted-series-connected bimorph actuator.

图6(a)是测试所得微镜的准静态响应曲线，当施加电压4 V 时，镜面垂直移动距离达到132 μm。微镜动态频率响应测试结果如图6(b)，第1 个频率峰值513 Hz 代表微镜垂直运动的谐振频率，第2 个频率峰值730 Hz 代表镜面扫描形成椭圆曲线时的谐振频率；第3 个频率峰值823 Hz 代表镜面扫描呈斜线模式的谐振频率。

图6 微镜特性曲线。 (a)准静态相应；(b)动态频率相应Fig.6 Characterization of the MEMS mirror.( a ) Quasi-static response； ( b ) Dynamic frequency response.

2.2 双光子荧光显微镜探头成像效果

用3D 打印机(Ultimaker 3，Ultimaker，中国)打印出显微镜探头，探头尺寸26 mm(L)× 12 mm(W)× 8 mm(H)，重量为5.6 g。

1)MEMS 微结构成像测试:测试用的MEMS 微结构，在光学显微镜下的结构图像如图7(a)所示。微结构由5 组重复的凹槽组成，每组凹槽对应的宽度分别为5、20、30、45、52 μm。

输出到样品的激发光功率为150 mW。 测试得到的最小尺寸凹槽的荧光图像如图7(b)，图中可以比较清晰地观察到凹槽形状，表明显微镜探头成像的横向分辨率至少可达到5 μm。

图7 微结构双光子荧光图像。 (a)微结构；(b)荧光图像Fig.7 Fluorescent image of micro structure.(a)Mirco structure； (b) Fluorescent image

2)生物样品成像测试:利用该显微镜探头成像系统对荧光细胞载玻片生物样品进行成像，生物样品是厚度16 μm 的染色小鼠肾细胞组织(F24630，Thermo Fisher，美国)，得到细胞组织的荧光图像如图8 所示。

图8 小鼠肾细胞组织荧光图像Fig.8 Fluorescent image of mouse kidney fluocells

3 讨论与结论

目前探头设计还存在不足，首先系统测试的图像分辨率与设计理论衍射极限横向分辨率相差较大，这可能与3D 打印探头精度有关，打印所使用的塑料材料影响了探头表面光洁度，虽经后期抛光处理，但还是可能影响光学器件的固定。 如采用精密机械加工，则可以明显提高探头的加工精度以及光学系统的对准，从而提升系统精度；另外，如选用高数值孔径物镜，也可以提高系统的光学分辨率。 目前探头光学系统的结构设计以及光学器件的选择，还有较多优化空间，有助于进一步缩小探头尺寸和重量。

基于本设计，如要实现三维成像，尚需基于当前的二维成像系统，增加探头的轴向调节功能，实现对生物样品的纵向扫描。 传统方案是采用步进电机控制显微物镜轴向微运动，但这样很难实现探头微型化。 如果采用本研究中执行器结构，把探头物镜与执行器粘贴，通过控制执行器进行物镜纵向微位移，实现对组织细胞的荧光三维成像[10]。 经过前期的设计与初步测试，该方案已取得了不错效果。

本研究设计了一种基于电热型微镜的双光子荧光显微镜探头，其结构尺寸26 mm(L)× 12 mm(W)× 8 mm(H)，重量5.6 g，测试结果显示，其横向分辨率至少可达5 μm。 未来对该探头的进一步改进和创新，可使其成为便携式显微镜成像系统的关键部件，成为促进解密大脑和治疗神经类疾病的利器。

(致谢:感谢美国佛罗里达大学周亮博士的指导和帮助)