电离辐射生物标志物γ-H2AX的检测技术研究进展*

刘 樱 熊忠华 夏斌元 陈 珊

（中国工程物理研究院材料研究所，绵阳 621907）

在真核生物中，脱氧核糖核酸（DNA）与组蛋白结合形成核小体，构成染色质的功能单位，而DNA双链断裂（DNA double strand break，DSB）是电离辐射引起DNA损伤的主要形式。当DNA双链发生断裂时，在断裂位点将出现组蛋白H2AX在39位丝氨酸（γ-H2AX）的磷酸化。磷酸化的γ-H2AX在DSB位点累积，同时募集多种参与DNA损伤修复的分子，形成修复灶，共同参与早期DNA损伤修复。利用抗磷酸化γ-H2AX的抗体检测，可建立电离辐射与磷酸化γ-H2AX焦点之间的关系［1-2］。1998年，Rogakou等［3］首次发现并报道了γ-H2AX可作为细胞DNA双链断裂的快速又敏感的信号分子，随后的大量研究发现，γ-H2AX焦点数量在电离辐射发生大约30 min后达到峰值，在24 h内迅速下降并在几天内下降到基线水平，具体时间取决于相应的辐射剂量，焦点数量也与辐射剂量相关［4-5］。采用γ-H2AX焦点法进行剂量估算需在放射后1~2 d内进行，这也使其成为目前时效性最高的辐射生物标志物之一。因此，近年来，γ-H2AX检测技术在快速辐射剂量估算、辐射应急分诊等方面的应用价值被国内外广泛重视，尤其在精准化、小型化、高通量化等方面开展了诸多研究工作。

1 γ-H2AX常用检测技术

目前，γ-H2AX的检测方法主要包括免疫荧光法（荧光显微镜和流式细胞术）、酶联免疫吸附测定法和免疫印迹法等，以上方法均基于免疫细胞化学技术，其原理为用标记的抗磷酸化γ-H2AX的抗体对目标细胞的磷酸化γ-H2AX进行定性、定位或定量检测。

1.1 免疫荧光法

免疫荧光法主要利用γ-H2AX单克隆抗体作为一抗，与细胞内DSB位点处的γ-H2AX特异性结合，再加入标记有荧光素的二抗，与一抗形成夹心结构，利用荧光显微镜或流式细胞术采集荧光信号，即可分析目标细胞内γ-H2AX含量（图1）。荧光显微镜观察是最直观且最便捷的检测技术，既可以对细胞内γ-H2AX焦点计数，又可定性获得其荧光强度大小，从而比较不同剂量下细胞内的γ-H2AX含量，但该方法存在主观误差，使得其准确度不高，目前已开发有多种图像分析软件对获得的荧光图像进行分析，可减少人为误差并节约时间，提高准确性。而流式细胞术可实现大批量样本中γ-H2AX的测定。

1.2 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是酶免疫测定技术中应用最广的技术。用于检测γ-H2AX的主要原理是以γ-H2AX的单克隆抗体作为γ-H2AX捕获抗体，组装在固相载体（如聚苯乙烯微量反应板）上，当含γ-H2AX的标本被捕获后，加入辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的检测抗体，形成夹心结构。再加入酶标底物（即TMB溶液）和终止液即可通过在450 nm波长处测吸光度（A）值获得标本中γ-H2AX的含量（图2）。无论在定量分析精确度上，还是标本处理流程上，ELISA都较荧光显微镜和流式细胞术更具优势，且可采用酶标仪和96孔板进行高通量测定，因此，近年来也被广泛用于γ-H2AX的测定。

1.3 蛋白质免疫印迹法

蛋白质免疫印迹是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移至固相支持硝酸纤维素膜（nitrocellulose membrane，NC膜）或聚偏二氟乙烯（polyvinylidene，PVDF）上形成印迹膜，印迹膜上的目标蛋白可以被特异性抗体识别并捕获。同时，利用酶或同位素标记的二抗作为信标，经过底物显色或放射自显影可对被捕获的目标蛋白进行信号示踪（图3）。

2 γ-H2AX检测技术进展

γ-H2AX的检测结果可反映出DSB损伤修复情况，其具有检测周期短、特异性与灵敏度较高的优点，可满足辐射剂量估算和辐射应急分诊的应用需求。目前，改进γ-H2AX检测技术，主要涉及减少采样量和检测时间、借助新型显微镜技术、传统技术改进、检测自动化以及其他增强检测效果的方法等，目的均为尽可能在更短时间、更少样品量和更高通量的情况下获得更清晰的检测结果。

2.1 样品量

辐射事故后，为尽早对受照人群进行初步剂量估计和早期分诊，需要在同一时间内对尽可能多的样本进行快速评估，因此检测时所需的样品量及其处理时间十分关键。常规检测方法需要从装有若干毫升体积血液样品的肝素管中，通过Ficoll密度梯度离心法获得足够多的淋巴细胞，再进行随后的洗涤、分离和固定步骤。Sowa等［6］比较了经静脉穿刺和Ficoll密度梯度离心获得的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）和指尖毛细管血中分离的单个核细胞（capillary blood mononuclear cells，CBMCs），同时利用间接免疫荧光法分析γ-H2AX焦点情况，发现CBMCs可替代PBMCs用于DSB分析。而Wojewodzka等［7］通过改变样品处理参数来评估其对γ-H2AX焦点的影响，并优化出一种理论上可应用于指尖血的微量测定方案。Moquet等［8］已开发出一种检测方法，只需少于0.1 ml的血液样品，在理论上也可以实现手指穿刺取样。该方法可将96个样品的处理时间从常规方法的15 h减少为约4 h。但是需要牺牲细胞数和焦点清晰度。Heylmann和Kaina［9］则通过将指尖血注入肝素化的微量红细胞压积玻璃毛细管中，然后将其涂抹于玻片上，即可实现分析一滴血液中的γ-H2AX焦点来检测DNA损伤，该方法简单、快速、廉价，允许大量的血液采样和长期存储，适用于人类和动物群体中遗传损伤的快速和大规模筛选。Johnston等［10］开发了一种不需要对血液样品进行过滤、富集或纯化的全血免疫分析方法，分析结果在0~5 Gy的剂量范围内呈线性关系，理论上可以将这种分析从实验室扩展到野外。

2.2 超分辨显微镜技术

通过光学检测在单细胞水平上评估电离辐射暴露后的DNA损伤反应和修复动力学，是γ-H2AX检测技术中常用的方法之一。近年来，借助新型超分辨显微镜技术，可以在纳米尺度上研究电离辐射在单细胞中的分子效应［11］。在生物标本中，纳米标记的分子结构可以精确到10 nm（可见光波长的1/50），这属于单个核小体、抗体、受体等的范围。而单分子定位显微镜（single molecule localization microscopy，SMLM）是目前最流行的超分辨技术之一。大多数单分子定位显微镜方法依赖于单个荧光团分子的随机光谱调制，如光活化定位显微镜（photo-activated localization microscopy，PALM）、荧光PALM（fluorescence PALM，FPALM）、随机光学重建显微镜（stochastic optical reconstruction microscopy，STORM）、直 接STORM（direct STORM，dSTORM）、基态耗尽显微镜（ground state depletion microscopy followed by individual molecule return，GSDIM）等。最近的大多数研究主要集中在对暴露于不同剂量γ射线辐射并在辐射暴露后不同时间点固定的细胞中，γ-H2AX特异性抗体进行SMLM研究［12-16］。

2.3 图像分析软件

提高光学检测水平可以更深入地对DNA损伤机制进行基础科学研究，但这些超分辨显微镜的使用会不同程度增加检测成本和时间，并不适用于现场和快速检测。而对获得的荧光图像进行准确地自动图像分析则不仅可以缩短分析时间，也可减少人为误差。使用图像处理和分析的自动γ-H2AX分析已被证明比人工分析的准确度和平行性高，因为人工分析不能提供诸如核的大小或焦点的强度等额外信息［17-18］。焦点的量化和表征理论上需要统计大量的细胞来确保结果的可信度，因此这需要利用合适的图像分析软件，例如包含有图像预处理和转换、有效信息的提取，以便进行进一步的数据分析［18］。目前，已开发有多种基于显微镜图像的开源或闭源的自动分析软件，包括ImageJ［19-20］、DeepFoci［21］、CellProfiler［22-24］、FociCounter［25］、FoCo［26］、FocAn［27］等，均能对基于γ-H2AX的细胞图像进行分析。开源软件相较闭源软件，因其具有可访问的源代码，使得用户可根据特定的需求对参数进行修改；分析过程透明可视化；免费提供给科研工作者使用等优点，成为许多科研工作中优先考虑使用的软件。表1比较了几种常用图像分析软件所具备的功能，ImageJ和CellProfiler可提供多种插件，进行批量处理，同时可获得逐步分析的结果；DeepFoci和FocAn可分析共聚焦显微镜获得的3D多通道数据，从而分析三维立体结构下的焦点分布情况；FociCounter仅可获得焦点及焦点强度等简单数据，但软件分析操作较为直观简洁。基于图像分析软件获得的结果会因参数设置的不同而存在明显差异，后续研究中需要建立统一的评判标准。

Table 1 Comparison of image analysis software functions表1图像分析软件功能比较

2.4 检测新技术

成像流式细胞术（imaging flow cytometry，IFC）将光学显微镜和流式细胞术的优势结合，使研究人员在快速分析大量细胞的同时，可根据细胞形态学结果辅证分析结果。Lee等［28］开发出一种基于成像流式细胞术的快速、高通量γ-H2AX检测方法，用于评估电离辐射暴露后人外周血细胞DNA双链断裂修复动力学，结果分析与已有文献的理论曲线相符［5］。基于成像流式细胞术建立的γ-H2AX检测方法可以提供一个高通量的实用平台，通过预测个体放射敏感性和与放疗相关的不良反应风险，促进精准医疗。

对于像磷酸化组蛋白γ-H2AX这类特定蛋白质的相对定量分析，酶联免疫吸附试验和免疫印迹法都需要先将细胞裂解后提取总蛋白质方可进行后续实验。细胞酶联免疫吸附法（cell enzyme-linked immunosorbent assay，cell-ELISA）和细胞内免疫印迹法（in cell Western，ICW）则无需裂解细胞，而是在细胞原位检测目标蛋白质，相较于传统方法，省略了前期细胞裂解物的制备、制胶、电泳以及转膜等费时又易出错的步骤，也极大减少了因裂解细胞获取总蛋白质时造成的损失，具有特异、灵敏及操作简便等特点。Matsuzaki等［29］和Tronnet等［30］分别利用这两种方法对检测γ-H2AX进行了尝试，并建立了一套灵敏便捷的检测方法。

近年来，利用高效液相色谱串联质谱技术（high liquid chroma-tography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）对γ-H2AX磷酸化位点进行定量检测，可实现细胞内γ-H2AX定量分析，该方法于2015年由Matsuda等［31］建立，军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所谢剑炜研究员课题组［32］亦建立和评估了γ-H2AX质谱定量检测技术在细胞基因毒性方面的应用，并获得了DNA损伤及修复动力学曲线，在化合物的基因毒性测试中显示了可行性及优越性。

3 自动化/便携式设备研制

改进生物剂量估算方法的检测速度和效率，有助于在出现放射性事故时提高救援速率，保存有限医疗资源，遏制大规模的恐慌。因此需要研制出可快速自动甚至便携式的生物剂量估算系统，用以评估可能的大量个人辐射照射剂量。

现有的商品化的自动化免疫荧光分析及显微系统如AKLIDES［33］、Europattern［34］和Nova View［35］等，均可在一定程度上实现γ-H2AX生物剂量测定部分自动化，从而缩短时间，提高效率。Garty等［36-39］研制出一种基于机器人的自动生物剂量检测 工 具 （rapid automated biodosimetry tool，RABIT），利用多种先进技术，实现了γ-H2AX生物剂量测定从样品分离到荧光成像全流程自动化。测试结果表明，RABiT可在18 h工作周期内完成对5 859个生物样本的测定。而针对现场辐射剂量生物测定，Bensimon Etzol等［40-42］搭建了一种可操作和便携移动的生物剂量测量设备DosiKiT，可基于血液和毛囊样本对辐射受照人群进行事故现场测量，从而获得全身和局部的剂量评估。Zhong等［43］则以微流控技术为基础，设计制作了一种便携式的集成设备，简化了γ-H2AX免疫荧光染色的方案，可在室温下40 min内实现全自动γ-H2AX免疫荧光染色，实验结果呈线性剂量响应关系，具有自动化、高效、经济实用等特点。以上三者的比较总结于表2中。

Table 2 Comparison of automation/portable devices表2自动化/便携式设备比较

4 总结与展望

随着核技术在国防事业、能源产业、农林业及医学诊断治疗中越来越广泛的应用，大规模暴露于电离辐射环境的风险也在增加。辐射事故应急处置要求快速对受照人员进行剂量评估，基于DNA损伤的γ-H2AX生物剂量测定方法可在较短时间内对辐照剂量进行估算，从而达到快速筛分受照人群以便于应急医学处置的目的。本文总结了近10年来国内外基于电离辐射生物标志物γ-H2AX的检测方法研究进展，作为电离辐射生物标志物，为缩短检测时间，提高检测效率，对γ-H2AX检测过程中的样品量、自动化图像分析技术、检测新技术等方面，国外学者均开展了一定深度的研究，国内学者则侧重于方法的应用和机制的研究，在检测技术改进方面仍存在差距与不足。在快速辐射剂量估算、辐射应急分诊方面，建立快速准确，可便携自动化的高通量γ-H2AX生物剂量测定方法是γ-H2AX作为电离辐射生物标志物未来最重要的研究方向之一，且具有极高的应用潜力。