响应面法优化苦瓜甙的提取工艺及其HPLC 测定

李 琪，张 慧，安 超，贾 佳，吴洪号

(青岛大学化学化工学院，青岛 266071)

苦瓜，葫芦科苦瓜属植物，又称癞葡萄、凉瓜、锦荔枝、癞瓜等。在中国南北方均有种植，环境适应性强，是一种常见蔬菜[1]。苦瓜味苦性寒，是功能食品的原料，有“药用蔬菜”[2-4]之称，具有清热解毒、养颜嫩肤、降血糖、养血滋肝等功效[5-6]。苦瓜中含有丰富的生物活性成分，其中一类是苦瓜甙。苦瓜甙，又称苦瓜苷或苦瓜皂苷，是苦瓜果实中特有的苷类。苦瓜甙具有降血糖、调节胰岛功能、修复β 细胞、增加胰岛素的敏感性、预防和改善并发症、调节血脂、提高免疫力、消炎等功效[7-9]。

乙醇常作为天然产物的提取剂，可以减少污染，增加提取过程中的安全，还可以回收利用，减少了溶剂的浪费，也降低了实验的成本[10-11]。提取的苦瓜甙主要是三萜类化合物，能够与香草醛高氯酸试剂发生显色反应[12-14]。作为苦瓜中的重要有效成分，苦瓜甙在功能性食品和药品研究领域受到了极大的关注，但目前对苦瓜甙的相关研究还较少。因此，为了提高苦瓜甙的利用率，进一步实现苦瓜甙的工业化生产，本研究通过响应面法优化从苦瓜中提取苦瓜甙的条件。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料与试剂 人参皂苷Rg1标准品；新鲜苦瓜购于青岛市利群生活超市。无水乙醇，天津市富宇精细化工有限公司；香草醛，天津市北联精细化学品开发有限公司；冰乙酸，青岛世纪星化学试剂有限公司；高氯酸，天津政成化学制品有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备 UV-2800 紫外分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；HH-2 数显恒温水浴锅，常州普天仪器有限公司；ALB-124 电子天平，赛多利斯（北京）科学仪器有限公司；JJ-1 增力电动搅拌器，上海梅香仪器有限公司；SHK-IIIS 循环水式多用真空泵，郑州科泰实验设备有限公司。

1.2 样品制备方法及检测

1.2.1 苦瓜甙的提取 将新鲜苦瓜洗净，切片，低温烘干，备用。

在三口烧瓶中加入准确称取的30 g 苦瓜干，加入450 mL 乙醇水溶液在一定温度下提取3 次，收集并合并提取液，减压条件下进行蒸发浓缩，得苦瓜甙浸膏。

1.2.2 最大吸收波长的选择 精确移取人参皂苷Rg1标准品溶液（浓度为0.1 mg·mL-1)1.0 mL 于10 mL 具塞试管中，水浴条件下使乙醇全部被蒸发，加入0.7 mL 8%的香草醛冰乙酸溶液，再加入5 mL高氯酸，摇匀，在60 ℃下水浴加热15 min，取出试管后，立刻用自来水冲凉至室温，通过紫外扫描得到吸收光谱[15-18]，确定人参皂苷Rg1标准品的最大吸收波长为543 nm。

1.2.3 标准曲线的绘制 精确移取人参皂苷Rg1标准品溶液（浓度为0.1 mg·mL-1)，分别取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 和1.6 mL 于10 mL 具塞试管中，水浴条件下使乙醇全部被蒸发，分别加入0.7 mL 8%的香草醛冰乙酸溶液，再加入5 mL 高氯酸，摇匀，在60 ℃下水浴加热15 min，取出试管后，立刻用自来水冲凉至室温，于检测波长543 nm 处测定吸光度，以吸光度（A）对人参皂苷含量（M/μg）作回归曲线[19]，得回归方程：M=167.4A+ 0.225 3，r= 0.999 5。

1.2.4 苦瓜甙含量测定 准确称取一定质量1.2.1中得到的浸膏，溶解在无水乙醇中，配成100 mL溶液，取1.0 mL 于10 mL 具塞试管中，水浴条件下使乙醇全部被蒸发，加入0.7 mL 8%的香草醛冰乙酸溶液，再加入5 mL 高氯酸，摇匀，在60 ℃下水浴加热15 min，取出试管后，立刻用自来水冲凉至室温，于检测波长543 nm 处测定吸光度，并代入1.2.3 中的回归方程得到苦瓜甙的含量。

1.2.5 苦瓜甙的HPLC 检测 所用的苦瓜甙对照品为实验室自制，UV 法测定纯度为83.90%。检测样品为初步纯化后的苦瓜提取物。具体试验参数如表1 所示。

表1 试验参数Table 1 Experiment parameters

色谱柱：Waters Novara C18 柱（∅ 4.6×250 mm）。

1.3 试验设计

1.3.1 单因素试验 （1）提取温度对苦瓜甙质量的影响。准确称取苦瓜干料30 g，选取乙醇溶液的浓度为70%，提取料液比为1:45，提取时间3 h，考察提取温度40、50、60、70 和80 ℃对苦瓜甙质量的影响。

（2）乙醇浓度对苦瓜甙质量的影响。准确称取苦瓜干料30 g，选取提取温度为60 ℃ ，提取料液比为1 : 45，提取时间3 h，考察乙醇浓度50%、60%、70%、80%和90%对苦瓜甙质量的影响。

（3）提取时间对苦瓜甙质量的影响。准确称取苦瓜干料30 g，选取乙醇溶液的浓度为70%，提取料液比为1:45，提取温度为60 ℃，考察提取时间1、2、3、4、5 和6 h 对苦瓜甙质量的影响。

1.3.2 响应面法试验设计 以乙醇溶液为提取液，在单因素试验的基础上，选取提取温度（A）、乙醇浓度（B）、提取时间（C）3 个因素为自变量，以试验中苦瓜甙的质量为响应值，按Box-Behnken Design(BBD)原理设计响应面试验[20-21]。根据试验结果进行优化分析，再进行验证实验以得到最优的提取工艺。根据单因素试验结果，响应面法试验设计如表2。

表2 试验因素与水平Table 2 Factors and levels in the experiment

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取温度对苦瓜甙质量的影响 由图1 可知，在其他提取条件相同时，提取温度在40 ～ 80 ℃范围内，在60 ℃以前随着提取温度的提高，提取得到的苦瓜甙质量也在增加，而在60 ℃后反而有明显的下降，可能是提取温度过高苦瓜甙发生分解导致质量减少。综合考虑，选择50、60 和70 ℃进行优化试验。

图1 提取温度对苦瓜甙质量的影响Figure 1 Effect of extraction temperature on the quality of charantin

2.1.2 乙醇浓度对苦瓜甙质量的影响 由图2可知，在其他提取条件相同时，乙醇溶液的浓度在50% ～90%范围内，随着乙醇浓度的上升，提取后得到的苦瓜甙质量先增加后减少。综合考虑，选择60%、70%和80%进行优化试验。

图2 乙醇浓度对苦瓜甙质量的影响Figure 2 Effect of ethanol concentration on the quality of charantin

2.1.3 提取时间对苦瓜甙质量的影响 由图3 可知，在其他提取条件相同时，在4 h 之前，随着提取时间的增加，苦瓜甙的质量也在增加，而在4 h以后随着提取时间的加长，苦瓜甙质量逐渐降低，推测可能的原因是在长时间的提取过程中苦瓜甙有衰减或发生了结构变化。综合考虑，选择3、4 和5 h 进行优化试验。

图3 提取时间对苦瓜甙质量的影响Figure 3 Effect of extraction time on the quality of charantin

2.2 响应面优化试验结果

2.2.1 Box-behnken 中心组合试验方案及结果 根据软件设计条件进行试验，测定不同提取条件下苦瓜甙的质量，试验设计及结果如表3。

表3 响应面试验及结果Table 3 Tests and results of response surface method

以苦瓜甙质量为指标，利用Design-Expert 8.0.6软件对表3 中的试验结果进行分析，得到苦瓜甙质量回归方程为：W= 0.74+0.032A-0.025B-0.048C+0.014AB-2.300E-003AC+ 0.081BC- 0.043A2-0.080B2-0.064C2。对回归方程进行方差分析，结果见表4。从表4 中可以看出，一次项A、B、C，交互项BC 和二次项A2、B2、C2对提取得到的苦瓜甙质量影响极显著，交互项AB 对提取得到的苦瓜甙质量影响显著，其他因素的影响不显著。易得影响苦瓜甙质量的因素顺序为：提取时间＞ 温度 ＞乙醇浓度。此模型的P＜0.000 1，响应面回归模型达到了极显著水平（P＜ 0.01），失拟项（P= 0.685 3 ＞0.05）不显著，变异系数1.73%（＜ 10%），说明非试验因素对结果影响不大，模型具有较好的试验稳定性。模型相关系数R2为0.992 4，这说明该试验模型与实际试验拟合较好，实际试验中约99.24%的结果可以通过拟合模型进行解释。校正后的决定系数R2Adj为0.982 6，与R2接近，说明模型有充分的准确性和通用性。因此可以用此模型来分析和预测苦瓜甙提取试验中各因素对提取率的影响[13,22]。

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis for the established regression model

2.2.2 Box-Behnken 响应面分析交互作用 在回归模型方差分析结果的基础上，采用Design-Expert 8.0.6 软件依据回归方程式，在回归模型方差分析结果的基础上绘制响应面图及等高线图，分析温度、乙醇浓度和提取时间对苦瓜甙质量的影响。当固定提取温度、乙醇浓度和提取时间3 个因素中的其中一个因素时，其他两个因素间的交互作用对响应值的影响可用等高线图和响应面图表示，结果见图4至图6。响应曲面和等高线图能直观反应交互作用对响应值的影响程度，曲面越陡，等高线越密集，则影响越显著，等高线越接近椭圆，两个因素的交互作用越强[22-24]。由图6（b）可知，乙醇浓度与提取时间的交互作用对苦瓜甙质量影响最大，温度与乙醇浓度的交互作用对苦瓜甙质量影响次之，温度与提取时间的交互作用对苦瓜甙质量影响不显著。

图4 温度与乙醇浓度对苦瓜甙质量的交互影响Figure 4 Interaction between temperature and ethanol concentration on quality of charantin

图6 乙醇浓度与提取时间对苦瓜甙质量的交互影响Figure 6 Interaction between ethanol concentration and extraction time on quality of charantin

图4 表示提取时间在中心水平时，提取温度和乙醇浓度的交互作用对苦瓜甙质量的影响。如图4所示，在乙醇浓度较低的情况下，随着提取时间的增加，得到的苦瓜甙质量先增加后减少；当乙醇浓度在较高水平时，提取得到的苦瓜甙质量随着反应时间的增加而增加。响应面的倾斜度较高，坡度较为陡峭，且等高线呈椭圆形，P＜ 0.05，说明提取温度和乙醇浓度的交互作用对提取得到的苦瓜甙质量的影响显著。

图5 表示乙醇浓度在中心水平时，提取温度和提取时间的交互作用对苦瓜甙质量的影响。在提取温度较低的情况下，随着提取时间的增加，得到的苦瓜甙质量先增加后减少；提取温度在较高水平时，提取得到的苦瓜甙质量与提取温度在较低水平有相同的变化趋势，则表示提取温度与提取时间的交互作用不显著。

图5 温度与提取时间对苦瓜甙质量的交互影响Figure 5 Interaction between temperature and extraction time on quality of charantin

图6 表示提取温度在中心水平时，乙醇浓度和提取时间的交互作用对苦瓜甙质量的影响。在乙醇浓度较低的情况下，随着提取时间的增加，得到的苦瓜甙质量减少；当乙醇浓度在较高水平时，提取得到的苦瓜甙质量随着反应时间的增加而增加。当提取时间在较低水平时，提取得到的苦瓜甙随着乙醇浓度的增加而减小；在提取时间较高的情况下，随着乙醇浓度的增加，提取得到的苦瓜甙质量减少。而且响应面的倾斜度高，坡度陡峭，表明了乙醇浓度和提取时间的交互作用极显著。

2.2.3 优化工艺验证实验 采用Design expert 8.0.6

软件求解方程，得到理想的提取条件为提取温度63.06 ℃，乙醇浓度65.34%，提取时间3.33 h，此时得到的苦瓜甙质量为0.766 7 g。考虑到实验室条件以及实际操作的可能性，将提取条件修正为提取温度63oC，乙醇浓度65%，提取时间3.3 h。进行3 次重复试验，平均值为0.765 8 g，此时苦瓜甙的得率为25.53 mg·g-1，与预测值基本相符。表明该提取条件参数可靠，具有实际应用价值[25]。

2.3 HPLC 检测结果

检测结果如图7 所示。其中图7（a）为对照品谱图，图7（b）为样品谱图。

图7 对照和样品HPLC 谱图Figure 7 HPLC spectrogram of the control and the tested samples

通过图7（a）可以发现，在试验条件下苦瓜甙的保留时间为2.518 min。经过对比，可以发现图7（b）中保留时间为2.596 min 的物质与苦瓜甙的保留时间相吻合，即可以证明试验中苦瓜提取物中含有苦瓜甙。

3 结论

在单因素试验的基础上选用Box-Behnken 中心组合设计方法设计响应面试验来进行工艺优化，得到二次回归模型，回归模型拟合好。选择响应面法进行优化试验比普通的正交试验法更直观，通过图形将各因素之间的交互作用表现出来，可以通过观察来选择试验设计中的最优条件[26]。最终确定的优化工艺为：30 g 苦瓜干在温度63 ℃、浓度65%、提取时间3.3 h 条件下，得到的苦瓜甙质量最高，为0.765 8 g，苦瓜甙的得率为2.553%。此条件下所得到的苦瓜甙质量与响应面法优化的预测值接近，说明优化方案具有可行性。研究采用绿色有机溶剂乙醇水溶液提取苦瓜中的苦瓜甙。该提取剂廉价易得，操作简单，污染小，实验过程安全，还可以回收利用，减少了溶剂的浪费，也降低了提取成本。同时，对提取物进行HPLC 检测，证明了苦瓜提取物中含有苦瓜甙。

本研究结果为从苦瓜中提取苦瓜甙的工业化生产提供技术支撑，为苦瓜的深度利用提供了理论依据和优化工艺参数，对苦瓜的综合利用具有一定的指导意义。