中等强度运动训练对慢性心力衰竭大鼠AMPK/PPARα信号通路的影响

★ 舒华 宋钊锐 郭磊磊 付蓉 许滔 余银翎 金爱林 杨炼 孙安会（.贵州中医药大学第二附属医院 贵阳 550000；.遵义市第一人民医院 贵州 遵义 56000；.贵州中医药大学 贵阳 550000；.开阳县中西医结合医院 贵州 开阳 55000）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是心脏疾病的终末阶段，已成为一个主要的公共卫生问题。以运动为主的心脏康复是心血管疾病二级预防的重要组成部分，目前指南［1-3］推荐心脏康复可在稳定期慢性心衰的患者中使用，其益处已经得到大量研究支持。心肌能量代谢障碍是CHF重要的机制之一，临床上改善心肌能量代谢的药物及手段越来越受到临床医生的关注。AMP激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）信号通路是调节细胞能量稳态的重要通路之一，通过激活AMPK及其下游信号通路，调节能量代谢信号因子，可有效改善心肌能量代谢，从而延缓心衰进展，达到治疗疾病的目的。本文通过建立阿霉素诱导的慢性心衰大鼠模型，检测各组大鼠心功能及AMPK/PPARα通路相关蛋白及mRNA，以期证实运动对AMPK/PPARα信号通路及心肌能量代谢的影响，为心脏康复治疗慢性心衰提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

实验动物选用健康雄性SD大鼠50只，2个月龄，体重（110±10）g，由湖南省长沙市天勤生物技术有限公司提供，实验动物生产许可证编号：SCXK（湘）2014-0011。实验期间将动物分笼饲养于贵州中医药大学实验中心，常规饲养。饲养1周后进行实验。

1.2 试药

盐酸阿霉素（北京索莱宝公司，货号：D8740）；AMPK抑制剂Compound C（MCE，货号：HY-13418A）；盐酸曲美他嗪片（施维雅＜天津＞制药有限公司）。

1.3 主要仪器

动物跑台（江苏赛昂斯，型号：SA101B）；超声仪（日本Fuji film ，型号：Visual Sonics Vevo 2100）；荧光定量RCP仪（Thermo公司，型号：PIKO REAL 96）；荧光PCR板（Thermo公司，型号：SPL0960）；水平琼脂糖电泳槽（北京六一生物科技有限公司，型号：DYCP-31DN）。

1.4 主要抗体

AMPK（美国CST），P-AMPK（Santa Cruz），PPARα（Novus），以上抗体来源为 Rabbit；β-actin（美国proteintech），抗体来源为Mouse。

1.5 分组、造模及干预

50只SD大鼠采用随机数字表法选取10只大鼠设为正常对照组，其余40只大鼠参考文献［4］腹腔注射盐酸阿霉素造模。将阿霉素配成2 mg/mL溶液，经腹腔注射建模，剂量1.5 mg/kg，共注射6周，每周2次。将存活且建模成功的36只大鼠按随机数字表法分为4组：CHF模型对照组9只、曲美他嗪组9只、运动组9只和运动+AMPK抑制剂组9只。

1.6 干预方案

运动训练于第7周开始进行，运动组、运动+AMPK抑制剂组大鼠每天在跑台上进行5 min的适应性训练（坡度为0°，速度为5 m/min），随后采用中强度运动训练，即将跑台调整为5°，20 m/min（根据 Bedford经验公式［5］，相当于60%最大摄氧量）。运动各组大鼠第1天运动20 min，第2天运动30 min，第3天运动40 min，此后运动量保持坡度5°，速度20 m/min，时间40 min，每周5 d，连续运动训练8周。各组干预方式见表1。

表1 各组大鼠实验干预方案

1.7 观察指标

1.7.1 各组大鼠的死亡率及一般情况 观察各组大鼠死亡率及一般情况，一般情况包括精神状态、活动、反应、皮毛、水肿、大便、进食、运动等。

1.7.2 心脏超声检查 于第6周末行心脏超声检查，按大鼠体重3 mg/kg剂量腹腔注10%水合氯醛溶液麻醉大鼠后由专业超声科医师操作。测量指标：左室射血分数（Left ventricular ejection fraction，LVEF）、左室短轴缩短分数（Left ventricular fractional shortening，LVFS）。于14周末，再次行心脏超声检查，检测指标：LVEF、LVFS、左室收缩末期内径（Left ventricular end-systolic dimension，LVDs）、左室舒张末期内径（Left ventricular enddiastolic dimension，LVDd）。

1.7.3 Western Blot检 测 心 肌 AMPK、P-AMPK、PPARα蛋白表达水平 取出大鼠心脏，取心肌组织，加裂解液，裂解细胞后提取细胞总蛋白，剪取0.025 g心肌组织后用预冷的PBS冲洗，匀浆器中加入250 μL RIPA裂解液后反复研磨组织。研磨好的组织置于冰上10 min后，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，离心后取上清。上清液按BCA蛋白定量试剂盒（Wellbio）的指示测定蛋白质浓度，作为WB检测的参考。经电泳→转膜→封闭→一抗孵育→二抗孵育→显色曝光后，得出结果。

1.7.4 Real-time PCR法检测心肌AMPK mRNA、PPARα mRNA表达水平 每只大鼠取0.2 g心肌组织研磨混匀，Trizol法提取组织总RNA，经离心、沉淀、电泳后，以细胞总mRNA为模板，逆转录cDNA。扩增体系为30 μL，扩增程序为95 ℃预变性10 min、95 ℃变性15 min、60 ℃退火60 s，40个循环。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，AMPK引物序列为上游GACCTCGGTCAAGTGTCG，下游TGGGTTATCAACGGGCTA，引物长度为177 bp；PPARα引物序列 为上游ATCCACGAAGCCTACCTGA，下游CCTTGGCAAATTCCGTGAGC，引物长度为250 bp；GAPDH引物序列为上游 CAGCAACAGGGTGGTGGAC，下游TTTGAGGGTGCAGCGAACTT，引物长度为252 bp。每个样本设3个复孔，采用SYBR法计算基因相对表达量。

1.8 统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行分析，数据采用均值±标准差（）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较符合正态分布及方差齐性时采用单因素方差分析，不符合正态分布时采用多个独立样本非参数检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠死亡率及一般情况

正常对照组无大鼠死亡，建模组大鼠死亡13只，死亡率26%，36只建模成功，1只未成功。在后期干预过程中，正常对照组、曲美他嗪组大鼠无死亡，其余3组大鼠各死亡1只。正常对照组大鼠实验过程中精神、健康状况良好，反应敏捷。各实验组大鼠在建模开始后陆续出现精神差，反应迟钝，进食减少，体重下降，四肢和或阴部和或腹部出现不同程度的水肿。至14周末模型对照组大鼠上述症状明显加重，曲美他嗪组及运动干预各组症状均较前减轻。

2.2 6周后各组大鼠LVEF和LVFS变化

建模6周后，与正常对照组比较，模型组LVEF和LVFS下降（P＜0.05），说明造模成功。见表2。

表2 6 周后各组大鼠LVEF和LVFS变化（） %

表2 6 周后各组大鼠LVEF和LVFS变化（） %

注：与正常对照组比较，*P＜0.05。

组别 n LVEF LVFS正常对照组 10 93.57±2.25 68.68±2.25模型组 36 73.09±2.06* 44.44±2.29*

2.3 14周后各组大鼠心脏功能变化

与正常对照组比较，造模各组LVEF和LVFS均下降，LVDd、LVDs均升高（P＜0.05）；与模型对照组比较，干预各组LVEF、LVFS均升高（P＜0.05），运动组 LVDd、LVDs下降（P＜0.05），曲美他嗪组、运动+AMPK抑制剂组LVDs下降（P＜0.05），LVDd比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与曲美他嗪组比较，运动组LVEF、LVFS升高（P＜0.05）、LVDd、LVDs比较差异无统计学意义（P＞0.05），运动+AMPK抑制剂组LVEF、LVFS下降、LVDs升高（P＜0.05），LVDd比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与运动组比较，运动+AMPK抑制剂组LVEF、LVFS下降（P＜0.05），LVDs升高（P＜0.05），LVDd比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 14周后各组大鼠心脏功能变化（）

表3 14周后各组大鼠心脏功能变化（）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，△P＜0.05；与曲美他嗪组比较，#P＜0.05；与运动组比较，&P＜0.05。

组别 n LVEF/% LVFS/% LVDd/mm LVDs/mm正常对照组 10 91.37±0.35 60.15±1.46 5.16±0.18 2.38±0.27模型对照组 8 66.89±1.00* 40.74±0.14* 6.86±0.88* 4.07±0.18*曲美他嗪组 9 75.21±0.30*△ 48.73±2.25*△ 6.26±0.49* 2.98±0.12*△运动组 8 82.89±0.39*△# 51.76±1.10*△# 6.03±0.07*△ 2.84±0.10*△运动 +AMPK 组 8 72.64±2.02*△#& 42.50±0.86*#& 6.48±0.51* 3.51±0.12*△#&

2.4 各组大鼠心肌AMPK、P-AMPK、PPARα蛋白表达水平

与正常对照组比较，各组间AMPK蛋白表达均无统计学差异（P＞0.05），各组P-AMPK均升高（P＜0.05）、运动组PPARα蛋白表达下降无统计学意义（P＞0.05），其余各组PPARα下降（P＜0.05）；与模型组比较，曲美他嗪组P-AMPK下降（P＜0.05），PPARα蛋白表达无统计学意义（P＞0.05），运动组 P-AMPK、PPARα 蛋白表达明显升高（P＜0.05）、运动+AMPK抑制剂组P-AMPK、PPARα蛋白表达无统计学意义（P＞0.05）；与曲美他嗪组比较，运动各组P-AMPK蛋白表达升高P＜0.05），PPARα蛋白表达差异均无统计学意义（P＞0.05）；与运动组比较，运动+AMPK抑制剂组P-AMPK蛋白表达下降（P＜0.05），PPARα蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 4、图 1。

表4 各组大鼠AMPK、P-AMPK、PPARα蛋白表达（）

表4 各组大鼠AMPK、P-AMPK、PPARα蛋白表达（）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，△P＜0.05；与曲美他嗪组比较，#P＜0.05；与运动组比较，&P＜0.05。

组别 n AMPK P-AMPK PPARα正常对照组 10 0.59±0.03 0.10±0.02 0.49±0.14模型对照组 8 0.59±0.03 0.25±0.03* 0.15±0.04*曲美他嗪组 9 0.59±0.06 0.13±0.01△ 0.29±0.07*运动组 8 0.61±0.09 0.39±0.04*△# 0.38±0.12△运动+AMPK抑制剂组 8 0.65±0.08 0.28±0.04*#& 0.24±0.08*

图1 各组大鼠心肌AMPK、P-AMPK、PPARα蛋白表达条带情况

2.5 各组大鼠心肌AMPK mRNA、PPARαmRNA表达水平

与正常组比较，其余各组AMPK mRNA、PPARα mRNA均下降（P＜0.05）；与模型组比较，运动+MPK抑制剂组AMPK mRNA、PPARαmRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05），其余各组AMPK mRNA、PPARαmRNA明显升高（P＜0.05）；与曲美他嗪组比较，运动组AMPK mRNA升高但差异无统计学意义（P＞0.05），PPARαmRNA升高（P＜0.05），运动+AMPK抑制剂组AMPK mRNA下降（P＜0.05），PPARαmRNA表达下降但无统计学意义（P＞0.05）；与运动组比较，运动+AMPK抑制剂组AMPK mRNA、PPARαmRNA表达下降（P＜0.05）。见表 5。

表5 各组大鼠心肌细胞AMPK mRNA、PPARαmRNA的表达情况（）

表5 各组大鼠心肌细胞AMPK mRNA、PPARαmRNA的表达情况（）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，△P＜0.05；与曲美他嗪组比较，#P＜0.05；与运动组比较，&P＜0.05。

组别 n AMPK mRNA PPARαmRNA正常对照组 10 2.63±0.25 1.00±0.04模型对照组 8 0.96±0.08* 0.28±0.06*曲美他嗪组 9 1.87±0.20*△ 0.60±0.13*△运动组 8 2.03±0.26*△ 0.80±0.12*△#运动+AMPK抑制剂组 8 1.37±0.27*#& 0.44±0.10*&

3 结论

心肌能量代谢障碍是CHF的重要病理机制之一，AMPK信号通路在其中发挥重要作用。低血糖、剧烈运动、缺氧和缺血均可激活AMPK，从而调节糖脂代谢［6］。过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）是AMPK的下游靶分子，二者形成AMPK/PPARα信号通路，在维持心肌能量代谢的稳定性中起重要作用［7］。许多研究表明，运动训练是预防及延缓心衰进程的重要方法，其机制可能是通过激活心肌AMPK来实现的。本实验结果表明，经8周中等强度运动训练后，运动组可明显改善CHF模型大鼠心功能，且P-AMPK、PPARα蛋白表达明显升高，证实了运动可激活AMPK/PPARα通路，并通过激活该通路改善CHF模型大鼠心功能；而运动+AMPK抑制剂组PPARα蛋白表达水平较运动前升高，这可能与PPARα蛋白存在多个上游因子有关；结果中存在蛋白及mRNA有表达不一致情况，考虑与mRNA翻译受很多因素调控有关。综上，本实验证实了运动训练能够通过激活AMPK/PPARα通路，从而调节心衰大鼠心肌能量代谢，改善心衰症状，延缓心衰进展。但本实验仅对AMPK/PPARα通路上两个重要蛋白进行检测分析，后续将完善该通路其他蛋白的检测，以期揭示运动调控AMPK/PPARα通路的更多机制，为运动防治心衰提供更多实验依据。