雷公藤甲素通过STAT3/PD-L1通路介导子宫内膜癌KLE细胞DNA损伤诱导细胞凋亡的作用机制研究

汪洁，杨彩凤，吴亚凡，赵涛

（1.保定市第二中心医院，河北 保定 072750；2.石家庄市第一医院，河北 石家庄 050011）

子宫内膜癌源于子宫内膜上皮性恶性肿瘤，是常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一。目前子宫内膜癌常规治疗主要是以手术为主，辅助以放疗、化疗、激素替代治疗等综合疗法[1]。早期患者经手术治疗后大多预后良好，死亡率较低，而癌症晚期或复发转移肿瘤患者，术后放疗、化疗或激素替代治疗等方法只能暂时控制，且有一定的副作用，严重影响患者的生存质量[2]。据统计，10年内死于子宫内膜癌的女性所占比例已经增加到22%，因此迫切需要研究出新的治疗方法及药物在杀伤肿瘤细胞的同时降低对机体的毒副反应，以提高患者的生存率及生存质量[3]。雷公藤是卫茅科雷公藤属木质藤本植物，具有祛风除湿、活血通络、消肿止痛、杀虫解毒之功效[4]。雷公藤甲素是雷公藤主要的有效成分，对多种癌症细胞具有抑制作用，其抗肿瘤作用主要与诱导细胞凋亡、干预细胞周期和抑制肿瘤新生血管形成等因素有关[5]。因此，本研究主要探讨雷公藤甲素如何通过诱导子宫内膜癌KLE细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。

1 材料

1.1 细胞系 人子宫内膜癌KLE细胞，购于中国科学院上海细胞库。

1.2 药物与试剂 雷公藤甲素（批号：111567，纯度≥98%，上海恒远生物科技有限公司）；胎牛血清（批号：F2442）、噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）试剂（批号：M2128）、DMEM-F12培养基（批号：D6421）、二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）（批号：D2650）均购自美国Sigma公司；Annexin V-异硫氰酸荧光素（flourescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（propidium Iodide，PI）细胞凋亡检测试剂盒（批号：C1052，碧云天生物技术有限公司）；STAT3激活剂RO8191（批号：691868-88-9，美国MedChemeExpress）；兔抗人磷酸化组蛋白H2AX（phosphorylated histone H2AX，γH2AX）单克隆抗体（批号：ab229914）、信号传导及转录激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）单克隆抗体（批号：ab68153）、p-STAT3单克隆抗体（批号：ab267373）、程序性死亡受体-配体1（programmed cell death-Ligand 1，PD-L1）单克隆抗体（批号：ab205921）、干扰素调节因子1（interferon regulatory factor 1，IRF-1）单克隆抗体（批号：ab243895）、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（批号：ab6721）均购自美国Abcam公司。

1.3 主要仪器 FACSCalibu流式细胞仪系统（美国BD公司）；Varioskan LUX多功能酶标仪（美国Thermo Fisher公司）；DHP-9402恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；DYCZ-20H电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；LSM900激光共聚焦显微镜（北京普瑞赛司仪器有限公司）。

2 方法

2.1 细胞培养 取常规冻存复苏的人子宫内膜癌KLE细胞，接种于体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 mg/mL链霉素的DMEM-F12培养基，置于含5% CO2的37 ℃恒温培养箱内培养。用0.25%胰酶-EDTA进行消化传代，选用处于对数生长期的细胞进行实验。

2.2 分组及药物处理 用DMSO溶解雷公藤甲素和RO8191，配制成0.1 mmol/L的雷公藤甲素母液和RO8191母液，-20 ℃冰箱保存备用；实验时用DMEM-F12培养基稀释雷公藤甲素母液，使培养基中雷公藤甲素浓度为40 nmol/L，DMSO最终浓度＜0.1%。将对数生长期的人子宫内膜癌KLE细胞分为对照组（DMSO）、雷公藤甲素组（40 nmol/L雷公藤甲素）、激活剂（0.2 μmol/L RO8191）+雷公藤甲素（40 nmol/L雷公藤甲素）组、激活剂组（0.2 μmol/L RO8191）。

2.3 细胞核形态观察 将用75%酒精浸泡过的盖玻片放入6孔板中，取对数生长期的人子宫内膜癌KLE细胞，经胰酶消化后，按1×106个/mL密度接种于盖玻片上，细胞贴壁后各组细胞分别更换为对应的培养基，每孔终体积为2 mL，培养24 h后，去除培养基，预温的PBS清洗6孔板，5 min×3次，用PBS配制4%多聚甲醛，滴加到盖玻片上，室温静置10 min，PBS清洗盖玻片5 min×3次。用Hoechst 33342室温避光染色10 min，PBS漂洗，5 min×3次。在无菌载玻片中心位置滴加5 μL抗荧光衰减封片剂，盖玻片烘干后倒扣于载玻片上。避光封片，晾干，4 ℃避光储藏，观察细胞核形态。

2.4 细胞抑制率检测 取对数生长期的人子宫内膜癌KLE细胞，胰酶消化后，用DMEM-F12培养基调整细胞密度为1×105个/mL接种于96孔板。细胞贴壁后，对照组、雷公藤甲素组、激活剂+雷公藤甲素组、激活剂组更换相对应的培养基，200μL/孔，分别培养24、48、72 h。在各个时间段结束前4 h每孔加20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，孵育4 h，每孔加150 μL DMSO，震荡8 min，用酶标仪检测各孔490 nm处的光密度（OD）值，计算抑制率。抑制率=（OD对照值-OD用药值）/OD对照值×100%。

2.5 细胞凋亡情况检测 取对数生长期的人子宫内膜癌KLE细胞经胰酶消化后，用DMEM-F12培养基调整细胞密度为1×106个/mL接种于6孔板，细胞贴壁后，各组细胞分别更换为对应的培养基，培养48 h，收集各组细胞，2 500 r/min离心5 min（离心半径8 cm），弃上清，加入4 ℃PBS漂洗，加入195 μL Binding buffer重悬细胞，加5 μL AnnexinV-FITC 4 ℃避光孵育15 min，加入10 μL PI染色5 min，在流式细胞仪中检测细胞凋亡情况。

2.6 细胞周期检测 取对数生长期的人子宫内膜癌KLE细胞经胰酶消化后按1×106个/mL接种于6孔板，细胞贴壁后分别更换相对应的培养基，培养48 h后，用胰酶消化后收集各组细胞，1 000 r/min离心5 min（离心半径8 cm），用4 ℃PBS漂洗2次后加入预冷的70%乙醇，4 ℃过夜固定，1 000 r/min离心5 min（离心半径8 cm），PBS漂洗2次，用核糖核酸酶消化30 min，用PI染液避光染色30 min，使用流式细胞仪进行细胞周期检测。

2.7 Western blotting法检测γH2AX、STAT3、p-STAT3、IRF-1、PD-L1蛋白相对表达水平 取对数生长期的人子宫内膜癌KLE细胞，按密度1×106个/mL接种于锥形瓶中，细胞贴壁后分别更换相对应的培养基，培养48 h后，收集细胞，提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，每孔加入蛋白样品40 μL，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转至PVDF膜上，TBST溶液洗膜3次，10min/次，用5%脱脂奶粉孵育1 h，加入1∶1 000稀释的γH2AX、STAT3、p-STAT3、IRF-1、PD-L1一抗，4 ℃摇床孵育过夜，TBST溶液洗膜3次，10 min/次，加入1∶4 000稀释的辣根过氧化物酶标记相应二抗，摇床室温孵育2 h。TBST溶液洗膜3次，10 min/次，加入适量ECL超敏发光液，应用凝胶成像系统显影，计算目的蛋白和β-actin蛋白条带灰度比值作为目的蛋白相对表达水平。

2.8 统计学方法 采用SPSS 24.0统计学软件分析数据，计量资料以“均数±标准差”（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两样本比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组KLE细胞的细胞核形态比较 与对照组比较，雷公藤甲素组、激活剂+雷公藤甲素组KLE细胞的细胞核增大，数量增多；激活剂组、对照组KLE细胞的细胞核较小，数量较少。（见图1）

图1 各组KLE 细胞的细胞核形态（×400）

3.2 各组KLE细胞的细胞增殖抑制率比较 与雷公藤甲素组比较，激活剂+雷公藤甲素组KLE细胞24、48、72 h细胞增殖抑制率均明显降低（P＜0.05），且雷公藤甲素组、激活剂+雷公藤甲素组KLE细胞的细胞增殖抑制率均随时间延长而增加（P＜0.05）。（见图2）

图2 各组KLE 细胞的细胞增殖抑制率比较（，n=3）

3.3 各组KLE细胞的细胞凋亡情况 与对照组比较，雷公藤甲素组、激活剂+雷公藤甲素组KLE细胞的细胞凋亡率明显升高（P＜0.05），激活剂组KLE细胞的细胞凋亡率明显降低（P＜0.05）；且雷公藤甲素组KLE细胞凋亡率高于激活剂+雷公藤甲素组（P＜0.05）。（见图3～4）

图3 各组KLE 细胞的细胞凋亡情况

图4 各组KLE 细胞的细胞凋亡情况比较（，n=3）

3.4 各组KLE细胞的细胞周期比较 与对照组比较，雷公藤甲素组、激活剂+雷公藤甲素组S期KLE细胞百分率均明显升高（P＜0.05），G2/M期KLE细胞百分率均明显降低（P＜0.05）；与对照组比较，激活剂组S期KLE细胞百分率明显降低（P＜0.05），G2/M期KLE细胞百分率明显升高（P＜0.05）；雷公藤甲素组S期KLE细胞百分率明显高于激活剂+雷公藤甲素组（P＜0.05），G2/M期KLE细胞百分率明显低于激活剂+雷公藤甲素组（P＜0.05）；4组G1期KLE细胞百分率组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见图5）

图5 各组KLE 细胞的细胞周期比较（，n=3）

3.5 各组KLE细胞γH2AX、STAT3、p-STAT3、IRF-1、PD-L1蛋白相对表达量比较 与对照组比较，雷公藤甲素组、激活剂+雷公藤甲素组KLE细胞γH2AX蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.05），p-STAT3、IRF-1、PD-L1蛋白相对表达量均明显降低（P＜0.05）；与对照组比较，激活剂组KLE细胞γH2AX蛋白相对表达量均明显降低（P＜0.05），p-STAT3、IRF-1、PD-L1蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.05）；雷公藤甲素组KLE细胞γH2AX蛋白相对表达量明显高于激活剂+雷公藤甲素组（P＜0.05），p-STAT3、IRF-1、PD-L1蛋白相对表达量明显低于激活剂+雷公藤甲素组（P＜0.05）；4组KLE细胞STAT3蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见图6～7）

图6 各组KLE 细胞γH2AX、STAT3、p-STAT3、IRF-1、PD-L1蛋白表达Western blotting图

图7 各组KLE 细胞γH2AX、STAT3、p-STAT3、IRF-1、PD-L1蛋白相对表达量比较（，n=3）

4 讨论

子宫内膜癌占女性生殖道恶性肿瘤的20%～30%，且发病率逐年递增。早期患者术后生存率高，但晚期患者发生转移或复发率高，预后较差。雷公藤甲素是从雷公藤中分离提取的一种环氧二萜类化合物，具有抗炎、抗生育及免疫调节等多种作用[6]。近年来研究发现，雷公藤甲素具有广谱抗肿瘤作用，能够抑制人胰腺癌、乳腺癌和宫颈癌细胞的增殖[7-9]。雷公藤甲素抗肿瘤机制可能涉及多种途径，如抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、抑制核因子-κB、调控半胱天冬氨酸蛋白酶通路、抑制基质金属蛋白酶的表达、影响血管新生和阻断肿瘤转移等[10]。

细胞凋亡是由基因控制的细胞自主有序的死亡过程，是具有独特细胞形态和生物化学变化的细胞死亡方式。细胞增殖与凋亡在正常情况下维持动态平衡，细胞增殖失控或凋亡受阻都可导致肿瘤发生。细胞周期是从上一次分裂完成开始到下一次分裂结束的整个过程，一个完整的细胞周期包括有丝分裂期（M期）和分裂间期（G1期、S期、G2期），细胞周期阻滞可以减慢细胞增殖速度、诱导细胞凋亡[11]。陈志等[12]研究表明雷公藤甲素能抑制人结肠癌HCT-116细胞增殖，通过促进p21的表达，抑制Cyclin D1使细胞周期阻滞于G0/G1期，并可通过线粒体途径诱导HCT-116细胞凋亡。张雅莉等[13]研究发现雷公藤甲素能改善子宫颈癌患者术后免疫功能、降低机体炎症反应、抑制肿瘤细胞的增殖，对子宫颈癌具有一定的治疗效果。李鑫等[14]研究发现低浓度雷公藤甲素联合高三尖杉酯碱可以抑制KG-1α细胞增殖，并诱导其凋亡。徐俊伟等[15]发现雷公藤甲素能抑制食管癌Eca-9706细胞增殖并促进其凋亡，从而抑制食管癌的进展。本研究中雷公藤甲素组KLE细胞增殖抑制率升高，细胞凋亡率高于对照组，S期细胞百分率升高，G2/M期细胞百分率降低，且雷公藤甲素组细胞核形态增大。DNA损伤是指在DNA复制过程中，DNA核苷酸序列发生改变，影响基因的复制和转录。γH2AX是双链DNA损伤的重要生物标志物，DNA损伤后可募集并激活ATM，从而促进γH2AX磷酸化，以达到DNA损伤修复的作用[16]。本研究结果表明雷公藤甲素可上调KLE细胞中γH2AX表达，提示雷公藤甲素通过介导子宫内膜癌KLE细胞DNA损伤，细胞周期阻滞停留在S期，进行DNA损伤修复，减慢细胞增殖，从而诱导细胞凋亡。

PD-1/PD-L1是形成肿瘤免疫耐受的关键分子。研究表明，PD-L1在多种实体瘤中高表达，帮助肿瘤细胞免疫逃逸。研究发现，STAT3在细胞增殖、存活及分化过程中发挥重要作用，是致癌信号传导过程中重要的介质，多种癌组织中均检测到STAT3高表达。IRF-1是重要的细胞内转录调节因子，能够被磷酸化的STAT3激活，调节PD-L1的表达，且IRF-1与PD-L1高表达密切相关[17]。研究发现，IRF-1通过使STAT3发生磷酸化而上调PD-L1的表达[18]。体外细胞实验发现，STAT3抑制剂可通过在S期诱导细胞凋亡和细胞周期停滞而显著抑制人胰腺癌细胞的增殖[19]。研究表明，STAT3在肺癌、乳腺癌、卵巢癌等多种肿瘤中异常表达，且阻断STAT3表达可以抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞凋亡[20]。依含等[21]研究发现STAT3可诱捕寡核苷酸抑制STAT3/IRF-1的信号通路，降低前列腺癌细胞PD-L1的表达。本研究中雷公藤甲素组p-STAT3、IRF-1、PD-L1蛋白相对表达量低于对照组、雷公藤甲素+激活剂组、激活剂组，提示雷公藤甲素通过抑制STAT3/PD-L1通路诱导人子宫内膜癌KLE细胞凋亡，发挥抑瘤作用。

综上所述，雷公藤甲素通过诱导子宫内膜癌KLE细胞DNA损伤，促进细胞凋亡，发挥抑瘤作用，可能是通过调控STAT3/PD-L1通路发挥作用。