响应面法优化肉桂精油微胶囊的制备工艺研究*

邹惠亮，陈柯，陈褚建，王新财，成霄，张诚贤，陈敏

（湖州市食品药品检验研究院，浙江 湖州 313000）

肉桂来源于樟科植物肉桂（Cinnamomum cassia Presl）的干燥树皮[1]，其提取物肉桂精油有着悠久且广泛的使用历史。肉桂精油的主要成分为肉桂醛和丁香酚等物质[2]。肉桂精油具有良好的抗氧化、抗菌活性[3-4]，在食品、药品及化妆品等领域都具有良好的开发前景[5]。但肉桂精油容易挥发及降解，其主要活性成分在空气中易氧化变质而导致功效降低[6-7]，使其应用受到限制。

将植物精油微胶囊化，能有效防止其氧化和降解，并且能够控制植物精油缓慢释放[8]。近年来，随着微胶囊技术的日益成熟，植物精油微胶囊在众多领域得到了广泛应用[9]。目前常用的微胶囊制备方法有喷雾干燥法、复凝聚法、超临界流体法等，其中复凝聚法具有操作简单、设备要求低、稳定性高等特点，是一种良好的微胶囊制备方法。至今已有松籽油、广藿香油、茶油和野坝子挥发油等通过复凝聚法被成功制备成微胶囊的研究报道[10-13]，但目前关于应用复凝聚法制备肉桂精油微胶囊并对其进行结构表征与性能研究的报道较少。

本研究以明胶与阿拉伯胶为壁材，肉桂精油为芯材，采用复凝聚法制备肉桂精油微胶囊，并以包埋率为主要指标对制备工艺进行优化，同时对微胶囊进行显微、红外光谱的结构表征和缓释性能的测定，以期为肉桂精油的开发利用提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 主要仪器 数显电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；76-1A型电动搅拌玻璃恒温水浴（常州国宇仪器制造有限公司）；UV2600型紫外分光仪（日本岛津公司）；Hicolet型红外分光光度计（美国热电公司）；T18型高速匀浆机（德国IKA公司）；DM2500型生物显微镜（Leica公司）；XS205DU型十万分之一电子分析天平（Mettler Toledo公司）；Mili-Q超纯水系统（Millipore公司）。

1.2 药物与试剂 肉桂精油（批号：BH14865，上海博湖生物科技有限公司）；明胶（批号：C11527215，上海麦克林生化科技有限公司，含有量99%，生物技术级）；阿拉伯胶（批号：C12115131，上海麦克林生化科技有限公司，医药级）；吐温-80（批号：C11717332，上海麦克林生化科技有限公司）；谷氨酰胺转氨酶（批号：Q15N11N130754，上海源叶生物科技有限公司）；冰乙酸（批号：20210129，国药集团化学试剂有限公司）；氢氧化钠（批号：20130530，国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 肉桂精油微胶囊制备 参照梁博等[12]的实验方法，并稍作修改。称取阿拉伯胶和明胶各2 g分别溶于100 mL蒸馏水中，备用。按比例称取一定量的肉桂精油与明胶溶液混合，同时加入2 mL吐温-80，6 000 r/min剪切乳化2 min，在一定温度的水浴中200 r/min的机械搅拌下，向肉桂精油混合乳液中逐滴加入阿拉伯胶溶液，搅拌均匀，随后滴加10%醋酸溶液，调节混合液pH值至预定值，同时在显微镜下观察至微囊形成，继续反应一定时间。从水浴取出烧杯，搅拌降温，随后移至冰浴中，急速降温至10 ℃以下，用10%的NaOH溶液调节pH值至6.0，加入谷氨酰胺转氨酶（固化剂）1 g，保持15 ℃搅拌固化3 h。室温下静置12 h，经离心、洗涤后，得到湿微胶囊，低温干燥，即得肉桂精油微胶囊。

2.2 肉桂精油线性关系考察 对肉桂精油进行全波段扫描后将紫外检测波长定为286 nm。将肉桂精油用无水乙醇稀释到不同浓度梯度，以无水乙醇作为空白对照，于286 nm波长下测定吸光度，以吸光度与样品浓度建立线性回归方程。并以肉桂精油浓度（μg/mL）为横坐标（X轴），吸光度为纵坐标（Y轴），绘制标准曲线，得回归方程Y=209.4X-0.009 7（R2=0.999 4），线性范围为2.0～10.0 μg/mL。

2.3 微胶囊包埋率测定 称取0.05 g微胶囊，加入一定量的无水乙醇，超声提取15 min，使其完全破壁溶解。过滤，将滤液稀释至合适的体积，在286 nm测定其吸光度，并根据标准曲线计算微胶囊中肉桂精油量[14]，然后计算微胶囊的包埋率。包埋率（%）=（微胶囊中肉桂精油的量/加入肉桂精油总量）×100%。

2.4 单因素试验 以包埋率为主要评价指标，选取壁芯比、复凝聚pH值、成囊温度、反应时间4个因素作为单因素考察的对象。

2.4.1 壁芯比对包埋率的影响 设定复凝聚pH值为3.5、成囊温度为40 ℃、反应时间为30 min，在不同壁芯比（1∶2、1∶1、2∶1、4∶1、8∶1）条件下按“2.1”项下方法制备微胶囊，并测定包埋率，结果见图1。在壁芯比1∶2～2∶1范围内，壁材浓度的增加可以提高微胶囊的包埋率；壁芯比大于2∶1时，包埋率反而降低。可能壁材浓度过低时不足以用来包埋体系中的肉桂精油，因此包埋率较低，随着壁材浓度不断增加包埋率也逐渐升高。但当壁材过多时，壁材会凝聚结块，影响微胶囊形成，浪费壁材。

图1 壁芯比对微胶囊包埋率的影响

2.4.2 成囊温度对包埋率的影响 设定复凝聚pH值为3.5、壁芯比为2∶1、反应时间30 min，在不同的成囊温度（25、35、45、55、65 ℃）下按“2.1”项下方法制备微胶囊，并测定包埋率，结果见图2。随着成囊温度的升高，包埋率先升高后降低。成囊温度在45 ℃时包埋率（77.02%）达到最高。当温度高于45 ℃时，包埋率明显降低。可能温度过高使壁材稳定性降低，微胶囊容易破碎，从而包埋率降低；但温度过低，壁材容易凝固，包埋率也降低。结果表明，成囊温度在35～55 ℃范围包埋率较高。

图2 成囊温度对微胶囊包埋率的影响

2.4.3 复凝聚pH值对包埋率的影响 设定壁芯比为2∶1、成囊温度为40 ℃、反应时间30 min，在不同复凝聚pH值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0）下按“2.1”项下方法制备微胶囊，并测定包埋率，结果见图3。复凝聚pH值为4.0时包埋率（81.87%）达到最高。因为阿拉伯胶在水中溶解带负电，呈弱酸性。明胶属于两性高分子材料，当pH值低于等电点时，明胶分子电离带正电，与带负电荷的阿拉伯胶相互凝聚，形成微胶囊。pH高于4.0时，明胶分子所带正电荷减少，因此微胶囊包埋率明显降低。故复凝聚pH值在3.5～4.5时包埋率较高。

图3 复凝聚pH 值对微胶囊包埋率的影响

2.4.4 反应时间对包埋率的影响 设定复凝聚pH值为3.5、壁芯比为2∶1、成囊温度40 ℃，在不同反应时间（15、30、45、60、75 min）下按“2.1”项下方法制备微胶囊，并测定包埋率，结果见图4。在15～30 min时，随着反应时间的延长，微胶囊包埋率呈上升趋势，在30 min时包埋率最大，为80.0%，当时间超过30 min时，微胶囊包埋率并没有增加。当反应时间延长到75 min时，可能因为反应时间过长，已形成微胶囊粘连聚集，导致囊壁破裂，包埋率稍微降低。故反应时间固定30 min为宜。

图4 反应时间对微胶囊包埋率的影响

2.5 星点设计-响应面法试验

2.5.1 试验设计 根据单因素试验结果，选取壁芯比（A）、成囊温度（B）、复凝聚pH值（C）3个对包埋率有显著影响的因素为自变量，分别对以上因素进行编码，并以微胶囊包埋率（Y）作为响应值，设计了3因素3水平共17个实验点的响应面分析试验，进一步优化工艺。因素和水平取值见表1。试验设计及结果见表2。

表1 响应面试验因素及水平

表2 响应面分析方案及试验结果

2.5.2 模型拟合及显著性检验 用Design-Expert8.0软件对所得数据进行回归分析，对各因素经过回归拟合后，得到回归方程Y=83.56+0.76A+1.84B+1.39C-0.52AB+0.065AC+1.37BC-3.15A2-3.25B2-2.81C2（R2=0.989 3），方差分析见表3。模型的显著水平（Prob＞F）明显小于0.05，方程的失拟项P值为0.073 8，表明模型拟合度良好。A、B、C、BC、A2、B2、C2为作用显著的影响因素，各实验因子对响应值的影响不是简单的线性关系。在各因素中，对包埋率影响由大到小的排列顺序依次为成囊温度、复凝聚pH值、壁芯比。

表3 方差分析表

2.5.3 响应面优化及验证 响应面交互作用图见图5。3D曲面图和对应的等高线的形状可以直观反映两自变量之间交互作用的显著性。图5显示壁芯比与成囊温度两者之间的交互作用较显著，表现为曲面较陡，对应等高线呈椭圆形，沿温度方向变化较快。在试验水平下，成囊温度对包埋率的影响比壁芯比显著。而壁芯比和复凝聚pH值及成囊温度和复凝聚pH值两两之间的交互作用不明显，等高线近似圆形。对模型方程求一阶偏导，得出模型的极值点，得到最佳制备条件为壁芯比2.1∶1、成囊温度48.5 ℃、复凝聚pH值4.2，在此条件下微胶囊包埋率的预测值为84.15%。采用上述条件进行3次验证试验，实际包埋率平均值为83.55%。实际值与预测值拟合度达99.29%，表明响应面法优化的肉桂精油微胶囊制备工艺合理可行。

图5 各因素交互作用响应面分析图

2.6 微胶囊的红外光谱分析 使用KBr压片法进行试验，将明胶、阿拉伯胶、肉桂精油、肉桂精油微胶囊分别与溴化钾混合并充分研磨后进行压片，红外扫描分析[15]，波长范围为4 000～400 cm-1，分辨率为2 cm-1，结果见图6。肉桂精油中含有肉桂醛、丁香酚等成分，具有-CHO和苯环等基团，在2 816.25、1 678.89、1 626.20、1 449.95 cm-1处存在较强的醛基和苯基的特征吸收峰（图6D）。肉桂精油微胶囊的红外图谱（图6C），可以看作是阿拉伯胶和明胶红外图谱的叠加，并且保留了肉桂精油的特征吸收峰1 681.36、1 450.42 cm-1，其中在3 300～3 500 cm-1内肉桂精油微胶囊对应峰的最高点是3 349.89 cm-1，说明明胶酰胺基团与阿拉伯胶中多糖携带的羟基形成氢键，从而使得C-O的伸缩振动峰向低波数移动。

图6 红外图谱

2.7 微胶囊显微形态观察 响应面试验优化后得到最佳制备条件下制备肉桂精油微胶囊，将肉桂精油湿微胶囊乳浊液直接滴在载玻片上，在生物显微镜下观察，并拍摄照片和测量粒径。通过显微镜观察可见球形微胶囊。粒径为20～30 μm。（见图7）

图7 微胶囊显微图（×40）

2.8 微胶囊缓释性考察 分别称取干燥后的肉桂精油微胶囊和肉桂精油各0.5 g若干份置于玻璃平皿中，放置在80 ℃的鼓风干燥箱中模拟释放[16]，每隔一段时间后测定肉桂精油微胶囊中肉桂精油的含量和称定对照组肉桂精油的质量，计算肉桂精油的释放率，以横坐标为释放时间，纵坐标为释放率，绘制释放曲线，结果见图8。随着加热时间的增加，肉桂精油和肉桂精油微胶囊均有部分精油挥发释放，但两者的释放率相差较大，在加热10 h时，肉桂精油的释放率达到75.87%，而肉桂精油微胶囊的释放率仅为25.02%，明显低于肉桂精油的释放率。由此可见，肉桂精油微胶囊化可以明显降低精油的释放速度，有利于肉桂精油持久长效地发挥其功效。

图8 微胶囊化的缓释效应

3 讨论

肉桂精油主要由肉桂醛等挥发性成分组成[17-18]，其在空气中挥发性强，不耐光热，易发生氧化分解，会影响使用效果，使其应用受到很大制约。微胶囊技术，即使用天然或人工合成的高分子材料包埋目标芯材的一门技术，可以使芯材不被腐蚀、不失活和抗氧化，增强活性物质的稳定性，有效减缓芯材的扩散和挥发[19-21]。借助微胶囊技术可以有效地控制肉桂精油缓慢释放，并能解决肉桂精油本身的稳定性和活性持久性问题。

本研究以明胶与阿拉伯胶为壁材，肉桂精油为芯材，采用复凝聚法制备肉桂精油微胶囊。通过Box-Behnken响应面试验，对微囊的制备工艺进行优化，得到最佳的工艺参数为壁芯比2.1∶1、成囊温度48.5 ℃、复凝聚pH值4.2。在此条件下微胶囊包埋率的预测值为84.15%，实测值为83.55%。验证试验证明工艺合理可行，红外光谱和显微观察证明微胶囊成功制备。缓释性研究结果表明，微胶囊化显著降低了肉桂精油的挥发释放速率。本研究使肉桂精油的使用性能得到显著提高，可为肉桂精油的进一步开发利用提供一定的参考依据。