重楼黄酮的提取工艺及其抗氧化功效验证

张正旭，褚佳豪，周云冬，吴迪，李学涛，彭效明，李翠清，居瑞军

（1.北京石油化工学院，北京 100000；2.云南白药集团股份有限公司，云南 昆明 650000；3.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110000）

重楼为云南重楼或七叶一枝花的干燥根茎[1]，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊的功效[2]，对治疗跌打损伤有独特疗效[3]，是多种中成药的主要原料之一[4-6]。重楼主要含有甾体皂苷、黄酮、多糖、植物脱皮激素和脂肪酸类等活性成分[7-8]。其中，黄酮化合物具有抗炎、杀菌、抗氧化和抗肿瘤等作用[9-11]。

黄酮类化合物是植物在生长过程中产生的一类次生代谢产物，主要贮藏在叶片之中，是药用植物的主要活性成分之一，具有抑制肿瘤细胞增殖、消除炎症、降低血压、抗衰老等生理活性[12-15]，是制备功能性食品和开发高效、低毒天然药物的重要原材料。黄酮一般难溶于水，易溶于乙醇、正丁醇、乙酸乙酯等有机溶剂。常见的提取方法有有机溶剂萃取法、甲醇提取法、碱法及超临界流体（CO2）萃取法[16-17]。有机溶剂萃取虽然操作方便，提取率高，但得到的精制物中容易混入较多杂质，后续分离困难；碱法提取杂质较少，提取物纯度高，但提取率较低；超临界流体萃取需要在高压的环境下进行，对设备的要求高，提取成本大；甲醇提取法具有提取设备要求简单、产物杂质少、提取率高等优点，但甲醇具有挥发性和毒性[18]。因此，本研究采用乙醇-水溶液作为溶剂，对重楼中黄酮类化合物进行提取，并采用单因素试验及响应面试验优化提取工艺条件，随后利用大孔吸附树脂进行纯化，以上样量、径高比、洗脱液浓度为指标，进行正交试验，优选最佳纯化精制工艺，并对取得的精制物进行抗炎功效验证，希望为重楼加工以及黄酮相关制品的制备工艺提供理论依据。

1 仪器与试剂

1.1 主要仪器 UV2600型紫外-可见光分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；SCIENTZ-10型冷冻干燥机（宁波新芝生物科技有限公司）；DF-101T型集热式加热磁力搅拌器（河南省予华仪器厂）；Centrifuge 5418 R型冷冻高速离心机（德国Eppendorf）；HBS-1096A型酶标仪（南京德铁实验设备有限公司）。

1.2 药物与试剂 重楼（产地云南，云南白药健康产品有限公司）；无水乙醇、氢氧化钠（分析纯，北京化工厂）；芦丁对照品（批号：512E031）、硝酸铝-九水合物、CCK-8、ABTS二铵盐、Na2EDTA、连苯三酚、K[Fe(CN)6]（大连美仑生物技术有限公司）；亚硝酸钠（分析纯，天津福晨化学试剂厂）；AB-8、D101、H103、SP825、HP-20大孔吸附树脂（沧州华众环保科技有限公司）；FeSO4·7H2O、K2S2O8、三氯乙酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）；水杨酸（北京索莱宝科技有限公司）；Tris（批号：409F051，北京索莱宝科技有限公司）；抗坏血酸（批号：CAN5456，富士フイルム和光純薬株式会社）；DPPH[批号：1898-66-4，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司]。

2 方法

2.1 芦丁线性关系考察 精密称取芦丁标准品5.0 mg，以纯化水定容至50 mL，配制成质量浓度为0.1 mg/mL的芦丁标准溶液。分别取芦丁标准溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0、2.2 mL到具塞试管中，加入70%乙醇水溶液1 mL，再加入5% NaNO2溶液0.3mL，摇匀静置6min，加入10% Al（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀静置6 min，加入10% NaOH溶液3.0 mL，摇匀静置15 min，配制得到不同浓度芦丁标准品溶液，在510 nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线，检测线性是否良好。

2.2 重楼黄酮样品的含量测定 取20 g重楼药材，在常温下粉碎，过10目筛。用60%乙醇按料液比为1∶10进行回流提取2次，提取时间为100 min，收集滤液为含黄酮的浸提液。滤液经减压浓缩，冷冻干燥得重楼黄酮样品D1，取适量重楼黄酮样品以60%乙醇水溶液溶解定容至100 mL，通过上述方法测定其黄酮含量。

2.3 单因素试验 根据“2.2”项下重楼黄酮的提取条件，固定料液比1∶10，提取时间100 min，考察乙醇浓度40%、50%、60%、70%、80%对重楼黄酮提取率的影响；固定乙醇浓度为60%，料液比1∶10，考察提取时间80、90、100、110、120 min对重楼黄酮提取率的影响；固定乙醇浓度为60%，提取时间100 min，考察料液比1∶6、1∶8、1∶10、1∶11、1∶12对重楼黄酮提取率的影响。

2.4 响应面试验设计 选定提取次数为2次，选用考察因数分别为乙醇浓度（X1）、提取时间（X2）、料液比（X3）。采用3因素3水平的Box-Behnken响应面法进行试验设计，以重楼总黄酮含量（Y）为因变量，优化提取工艺。因素值及水平值见表1。

表1 重楼黄酮提取的响应面设计试验因素和水平

2.5 静态吸附与解吸附 分别取10 g经过预处理的AB-8、D101、H103、SP825、HP-20大孔树脂装入250 mL的锥形瓶中，再加入浓度为0.175 mg/mL重楼黄酮D1粗提液100 mL，以25 ℃恒温振荡24 h，待树脂充分吸附粗提液后，过滤，测定滤液重楼总黄酮的含量，计算树脂的吸附量。

将上述吸附饱和的大孔树脂装入250 mL锥形瓶中，加入95%乙醇100 mL，25 ℃恒温振荡24 h充分解析后，过滤，测定滤液的重楼黄酮的含量，计算解析率。根据吸附率和解析率确定最适合的大孔树脂。

2.6 静态吸附曲线的绘制 分别取10 g经过预处理的D101大孔树脂装入250 mL的锥形瓶中，再加入浓度为0.08 mg/mL的重楼黄酮D1粗提液100 mL，25 ℃恒温水浴，200次/h振荡。每隔一段时间取样，进行吸光度检测，求得黄酮浓度，进而计算树脂吸附量。树脂进行3次重复试验，计算3次重复试验的平均值。

2.7 黄酮精制样品的制备 根据上述筛选的最佳树脂D101进行湿法装柱，将重楼黄酮D1粗提液配制成50 mg/mL，静态吸附3 h，然后分别用20%乙醇（2 BV）、40%乙醇（2 BV）及60%乙醇（4 BV）进行洗脱，收集洗脱液进行减压浓缩进行冻干，依次标注D2、D3和D4，取适量依次测量其含量。

2.8 重楼黄酮的抗氧化功效验证

2.8.1 DPPH自由基清除能力检测 取200 μL的待测液与等体积的2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀（A1管）；取等体积的水与2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀（A2管）；取等体积的无水乙醇与待测液混匀（A3管）；反应30 min后，在520 nm下测A1、A2和A3管的吸光度值，按照下面公式计算各样品的自由基清除率。称量0.10 g VC粉末，用蒸馏水定容到100 mL容量瓶中，现用现配，作为阳性对照。每个样品设置6个不同的浓度，每个浓度重复测定5次。

清除率=[(A2+A3)-A1]/A2×100%

2.8.2 OH自由基清除能力检测 准确量取0.166 8 g FeSO4粉末，用蒸馏水定容到100 mL容量瓶中，现用现配。取25 μL的30%H2O2，加40.85 mL蒸馏水稀释混匀，现用现配。准确称量0.041 4 g水杨酸粉末，用无水乙醇定容到50 mL容量瓶中。称量0.10 gVC粉末，用蒸馏水定容到100 mL容量瓶中，现用现配，作为阳性对照。按照表3的方案加入各种试剂，然后在520 nm处测定吸光度值，按照下面公式计算各样品的清除率。每个样品设置6个不同的浓度，每个浓度重复测定5次。（见表2）

表2 OH 自由基清除能力反应体系

清除率=[（A-C）-（B-D）]/（A-C）×100%

2.8.3 ABTS自由基的清除能力检测 准确称取ABTS二铵盐60 mg，加蒸馏水16 mL溶解，准确称取K2S2O810.8 mg，加蒸馏水16 mL溶解，将等体积的ABTS与K2S2O8溶液混合，室温避光放置12 h，得ABTS备用液。ABTS备用液加10倍量的蒸馏水稀释，得ABTS检测液。取30 μL的待测液与300 μL的ABTS检测液混匀（A1管），取30 μL蒸馏水与300 μL的ABTS检测液混匀（A2管），取30 μL待测液与300 μL的蒸馏水混匀（A3管），各组混匀后，室温静置6 min，在405 nm下测A1、A2和A3管的吸光度值，按照下面公式计算各样品的自由基清除率。称量0.10 g VC粉末，用蒸馏水定容到100 mL容量瓶中，现用现配，作为阳性对照。每个样品设置6个不同的浓度，每个浓度重复测定5次。

清除率=[(A2+A3)-A1]/A2×100%

2.8.4 对Fe3＋的还原能力检测 取200 μL待测液，分别加入等体积的磷酸盐缓冲液（pH值=6.6）及1%K[Fe(CN)6]，混匀后于50 ℃的电热恒温水浴锅中放20 min。急速冷却，取出后向各管加入200μL的10%三氯乙酸，混匀后，3 500 r/min离心10 min。取上层清液200 μL，依次加入200 μL蒸馏水和50 μL的0.1%FeCl3，混匀，作为待测组分。在630 nm处测定吸光度值（A）。A越大，则样品的还原力越大。称量0.20 g VC粉末，用蒸馏水定容到100 mL容量瓶中，现用现配，作为阳性对照。每个样品设置6个不同的浓度，每个浓度重复测定5次。

3 结果

3.1 芦丁标准曲线 采用亚硝酸钠-硝酸铝显色法测定重楼中总黄酮的标准曲线，根据测定的一系列浓度和对应的吸光度值，将数据拟合。方程为：Y=12.126X-0.022 2，R2=0.999 3。表示线性较好，可用于试验操作。（见图1）

图1 芦丁标准曲线

3.2 单因素试验结果

3.2.1 乙醇浓度 随着乙醇浓度的增加，总黄酮提取量呈先升高后降低趋势。当重楼黄酮含量达到最大值时乙醇浓度为60%，故选取60%乙醇作为提取溶剂。（见图2）

图2 乙醇浓度对重楼黄酮提取效果的影响

3.2.2 提取时间 重楼黄酮含量随着提取时间的延长呈先升高后下降趋势。当提取时间为100 min时，重楼黄酮含量达到最大值。这可能由于随着时间的延长，重楼总黄酮在提取溶剂中被不断溶出，但随着时间延长，其他杂质也会随之明显增加，使得重楼黄酮含量下降。因此，选取提取时间为100min。（见图3）

图3 提取时间对重楼黄酮提取效果的影响

3.2.3 料液比 在较低料液比时重楼黄酮含量比较低，随着料液比的不断增加，重楼黄酮的含量也在不断增加。当料液比达到1∶10时，随着料液比的不断增加，重楼黄酮含量逐渐趋于稳定。出于时间、人力资源等因素考虑，选取料液比为1∶10。（见图4）

图4 料液比对重楼黄酮提取效果的影响

3.3 响应面法试验结果 重楼黄酮的响应面试验结果见表3，模型的方差分析见表4，各交互因素响应曲面及相应的等高线图见图5～7。利用软件对重楼黄酮含量的实验数据进行拟合，得到重楼黄酮含量和乙醇浓度（X1）、提取时间（X2）和料液比（X3）3三个自变量之间的模型。回归方程为：Y=1.06+0.13X1+0.12X2+10.045X3-7.000E-003X1X2+7.000E-003X1X2+7.250E-003X1X2-0.25X12-0.26X22-0.21X32。经过响应面的工艺优化，得到最优提取工艺条件为，提取乙醇浓度65.03%，提取时间104.75 min，料液比1∶10.23。为了方便实施操作，选取提取乙醇浓度65%，提取时间105 min，料液比1∶10为最佳提取工艺条件。

表3 重楼黄酮响应面实验结果

表4 重楼黄酮方差分析结果

图5 实验因素X1和X2 对结果Y 影响的响应图与等高线图

图6 实验因素X1和X3 对结果Y 影响的响应图与等高线图

图7 实验因素X2和X3 对结果Y 影响的响应图与等高线图

3.4 最佳树脂的选择 取质量浓度为0.175 mg/mL重楼黄酮D1提取液100 mL,进行大孔树脂吸附试验。试验结果显示大孔树脂吸附率由高到低依次为AB-8、D101、SP825、HP-20、H103，数据之间差异无统计学意义（P＞0.05）。而大孔树脂解析率由高到低依次为HP-20、D101、SP825、H103、AB-8，数据间的差异较为明显。以上试验数据表明：虽然HP-20解析率相对优于D101，但究其原因是吸附量小于D101，导致解析率高于D101，解析量低于D101，综合比较纯化效果可知D101纯化效果最好。（见表5）

表5 5 种大孔树脂对重楼黄酮的吸附解析效果

3.5 静态吸附曲线 重楼黄酮静态吸附曲线见图8。在3 h内，D101大孔吸附树脂对重楼黄酮的吸附量随时间的增加而增加，在3 h后吸附趋于平衡状态，即3 h就可达到重楼黄酮静态吸附平衡，且最大吸附量为2.2 mg/g。

图8 大孔树脂吸附重楼黄酮吸附量随时间的变化关系图

3.6 黄酮精制样品的制备 用不同浓度的洗脱液进行梯度洗脱，收集不同洗脱段溶液进行减压浓缩、冷冻干燥，依次标注为D2、D3和D4，冻干后称质量并测定其含量，结果见表6。

表6 不同组分重楼黄酮的含量信息表

3.7 重楼黄酮抗氧化功效验证结果分析

3.7.1 DPPH自由基清除能力检测结果 重楼黄酮D1～D4组分都有一定的DPPH自由基清除作用。在质量浓度为5 mg/mL时，DPPH自由基的清除率分别为（81.94±7.39）%、（32.49±6.08）%、（60.38±2.84）%、（55.49±0.91）%。由于重楼黄酮D2和D3与DPPH反应生成黄色物质，该物质在520 nm处有吸收，导致其自由基清除结果不明显。但结合到实验观察到的现象，可知DPPH自由基清除能力大小为：重楼黄酮D2＞重楼黄酮D3＞重楼黄酮D1＞重楼黄酮D4。（见图9）

图9 重楼黄酮不同组分对DPPH 自由基清除能力比较

3.7.2 OH自由基清除能力检测结果 重楼黄酮D1～D4组分都具有一定的OH自由基清除作用。在质量浓度为6 mg/mL时，OH自由基的清除率分别为（39.11±1.67）%、（74.02±3.78）%、（57.53±3.08）%、（29.31±1.40）%。可知不同组分对OH自由基清除能力大小为：重楼黄酮D2＞重楼黄酮D3＞重楼黄酮D1＞重楼黄酮D4。（见图10）

图10 重楼黄酮不同组分对OH 自由基清除能力比较

3.7.3 ABTS自由基的清除能力检测结果 重楼黄酮D1～D4组分都具有一定的ABST自由基清除作用。在质量浓度为6 mg/mL时，ABTS自由基的清除率分别为（57.95±3.69）%、（100.89±0.56）%、（106.32±0.71）%、（73.88±0.94）%。可知不同组分重楼黄酮组分对ABST自由基清除能力大小为：重楼黄酮D3＞重楼黄酮D2＞重楼黄酮D4＞重楼黄酮D1。（见图11）

图11 重楼黄酮不同组分对ABTS 自由基清除能力比较

3.7.4 对Fe3＋的还原能力检测结果 重楼黄酮D1～D4都具有一定的Fe3＋的还原能力作用。在质量浓度为8 mg/mL时的吸光度分别为（0.30±0.04）、（0.40±0.01）、（0.35±0.01）、（0.24±0.00）。可知不同组分对Fe3＋的还原能力大小为：重楼黄酮D2＞重楼黄酮D3＞重楼黄酮D1＞重楼黄酮D4。（见图12）

图12 重楼黄酮不同组分对Fe3＋的还原能力比较

综上，功效验证结果表明不同提取物之间的抗氧化效果为：重楼黄酮D2（20%乙醇洗脱）＞重楼黄酮D3（40%乙醇洗脱）＞重楼黄酮D1粗提物＞重楼黄酮D4（60%乙醇洗脱）。

4 结论

通过单因素和响应面设计试验，可得重楼黄酮的最优提取工艺为提取乙醇浓度65%，提取时间105 min，料液比1∶10。利用该条件可提取得到重楼黄酮粗提物D1。重楼黄酮精制工艺的探索，筛选了5种大孔吸附树脂，得到D101树脂更有利于重楼黄酮的提取。利用20%乙醇、40%乙醇及60%乙醇对重楼黄酮粗提物D1在大孔树脂D101上进行洗脱，最终获得不同组分精制物D2～D4。对D1～D4的抗氧化功效进行研究，包括对DPPH、OH、ABTS自由基清除能力及对Fe3+还原能力的试验，可以得到重楼黄酮D2组分（20%乙醇洗脱）。重楼黄酮组分D2组分，有非常好的抗氧化能力。其次为重楼黄酮D3（40%乙醇洗脱），活性均高于重楼黄酮粗提物D1。表明重楼黄酮中具体抗氧化活性的有效部分可能在20%和40%乙醇洗脱组分中。重楼的大孔吸附树脂20%、40%乙醇洗脱部分富集到的黄酮为抗氧化主要活性部位，这些结果为重楼黄酮作为功能原料或药物的开发提供参考。