胆碱色氨酸离子液体对杜仲叶黄酮的提取*

任海琴，王润平

(黔南民族师范学院化学化工学院，贵州省普通高校民族药用植物资源开发工程研究中心，贵州 都匀 558000)

离子液体是一种熔融盐，其中一些在室温或接近室温下以液体形式存在，可以在纯溶液和水溶液中充当各种化合物的增溶溶剂[1]，因此已应用于来自生物物质中的活性成分和附加值化合物的提取[2-5]。杜仲是杜仲科植物多年生落叶乔木[6]，分布广泛，主要集中在广西、张家界、四川、贵州等地。杜仲中含有黄酮类、环烯醚萜类、杜仲胶、木脂素类及苯丙素类等多种具有生物活性的成分[7]。现代研究表明，杜仲叶含具有抗氧化、抗疲劳、抗衰老、抗瘤性、降低血脂、调节免疫等多种作用的黄酮[8]。因此，本文制备了一种新型绿色溶剂-胆碱色氨酸离子液体提取杜仲叶黄酮。

1 实 验

1.1 材料与仪器

杜仲叶(贵州本地采摘)；芦丁标准品；色谱级甲醇；氯化717阴离子交换树脂。空气恒温振荡器，培英THZ-D；紫外可见分光光度计，北京普析TU-1901；超纯水机，艾科浦AWL-0501-M；真空干燥箱，上海精宏DZF-6050；旋转蒸发仪，步琪R-100等。

1.2 胆碱色氨酸离子液体的制备

首先用饱和NaCl溶液浸泡717阴离子树脂，后用去离子水清洗干净。用4% HCl溶液浸泡树脂4 h，后用去离子水洗至中性；接着用4% NaOH溶液浸泡4 h，去离子水洗至中性后，重复以上步骤2～3次。将处理好的树脂装进柱子，将4% NaOH溶液倒入柱子进行阴离子交换，用5%AgNO3-HNO3溶液检测柱下滤液是否含有氯离子。若无氯离子，则用蒸馏水洗至中性，然后向柱中树脂内加入一定量的氯化胆碱进行交换，并收集交换出的氢氧胆碱。

图1 胆碱色氨酸离子液体的合成路线Fig.1 Synthetic route of choline tryptophan ionic liquid

称取一定量的色氨酸加入圆底烧瓶里，加入适量的水；按照摩尔比氢氧胆碱:色氨酸=1:1.1用分液漏斗缓慢滴加氢氧胆碱溶液，在室温下借助磁力搅拌反应12 h，具体合成路线见图1。用旋转蒸发仪将水旋干后，加入适量的甲醇与乙腈的混合溶剂，使未反应完的色氨酸沉淀出来，滤去沉淀，将其旋干后，利用真空干燥箱将其烘干，重复操作三次，得到较纯净的胆碱色氨酸离子液体，并用核磁共振氢谱进行表征。

1.3 胆碱色氨酸离子液体对杜仲叶组织的渗透

称取少量的杜仲叶粉末分别加入装有40%的色氨酸离子液体和纯水的试管中，在25 ℃恒温摇床中提取1 h后，离心，将离心液和杜仲叶渣分离后，把提取后的杜仲叶渣置于45 ℃鼓风干燥箱中烘干粉粹并用扫描电镜进行检测。

1.4 胆碱色氨酸离子液体对杜仲中黄酮的提取

用一定浓度的胆碱色氨酸离子液体提取一定量的杜仲叶粉末，在一定温度下震荡提取一定时间，离心后弃掉固体叶渣收集离心液。单因素实验：

(1)称取质量为0.3 g左右的杜仲叶粉末分别放入5组小烧杯，按照提取体系离子液体含量30%分别加入胆碱色氨酸离子液体和水，分别在25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃下震荡提取90 min。

(2)称取5组质量分别为0.3 g、0.5 g、0.7 g、0.9 g、1.1 g左右的杜仲叶粉末放入小烧杯，按照提取体系离子液体含量30%分别加入胆碱色氨酸离子液体和水，25 ℃下震荡提取90 min。

(3)称取质量为0.3 g左右的杜仲叶粉末分别放入5组小烧杯，按照提取体系离子液体含量30%分别加入胆碱色氨酸离子液体和水，在25 ℃下分别震荡提取150 min、120 min、90 min、60 min、30 min。

1.5 总黄酮含量的紫外测定

测定方法按照文献的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法[9]，精确吸取标准对照品1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL分别置于25 mL的容量瓶中，向每个容量瓶中分别加入1 mL 5%的亚硝酸钠，过6 min后加入1 mL 10%的硝酸铝溶液，再过6 min后加入10 mL 4%的氢氧化钠溶液，用40%的甲醇定容，混匀，放置15 min后在λ=510 nm处测量其吸光度A制作总黄酮的标准曲线。用移液枪分别吸取上述提取液离心后的上清液100 μL分别置于25 mL的容量瓶中，按上述方法测定各上清液的吸光度A，并用以公式(1)计算其提取率Y：

(1)

式中：C、V分别表示离心后上清液的浓度和体积， M为所称杜仲叶粉末的质量。

2 结果与讨论

首先，胆碱色氨酸离子液体恒温振荡浸提过的杜仲叶组织的电镜扫描观测结果显示，显碱性的胆碱色氨酸离子液体溶液能较好地破坏杜仲叶细胞壁结构，使其中的溶质分子较易渗出，从而易于后面杜仲叶总黄酮的提取。同时，基于胆碱色氨酸离子液体的恒温振荡浸提杜仲叶单因素实验得出提取温度、杜仲叶粉末质量和提取时间显著影响提取液离心后上清液的总黄酮浓度和杜仲叶总黄酮产率Y。

2.1 胆碱色氨酸离子液体对杜仲叶组织的渗透

图2 胆碱色氨酸离子液体浸提后的杜仲叶组织 电镜扫描结果Fig.2 Scanning results of eucommia leaf tissue extracted with choline tryptophan ionic liquid

根据图2的电镜扫描观察结果可以看出，碱性的胆碱色氨酸离子液体溶液作为溶剂能有效地破坏杜仲叶组织，并渗透进入组织内部，从而使杜仲叶中的活性成分溶出，达到提取总黄酮的目的。

2.2 提取温度的影响

表1 相同提取体系下提取温度对杜仲叶总黄酮提取产率的影响Table 1 Effect of extraction temperature on the yield of total flavonoids in Eucommia ulmoides leaves under the same extraction system

在总体系离子液体含量30%、杜仲叶粉末质量0.3 g左右、振荡提取90 min的提取体系下，随着提取温度的增加，离心后收集的上清液体积也开始逐步增加，45 ℃时到达最大值6.8 mL，此后开始逐渐降低；随着温度的上升，上清液总黄酮浓度和总黄酮提取产率也基本保持相同的趋势，在55 ℃时黄酮的提取率最高，为2.57%，上清液总黄酮浓度为1.2465 mg/mL，当温度继续增加，上清液总黄酮浓度和杜仲叶总黄酮的提取产率降低，这可能是温度过高，碱性的胆碱色氨酸离子液体溶液加速杜仲叶组织中的半纤维素、木质素、纤维素等的溶出，导致收集的上清液体积减少和相关活性物质的浓度降低，从而导致杜仲叶总黄酮的提取率降低。

2.3 杜仲叶粉末质量的影响

在总体系离子液体含量30%、25 ℃振荡提取90 min的提取体系下，随着提取原料杜仲叶粉末的增加，离心后的上清液总黄酮浓度和总黄酮产率都分别在上升，但收集的上清液体积却在逐步降低，这是因为随着杜仲叶粉末质量的增加，提取体系的粘度增加，离心时导致杜仲叶残渣中滞留的溶液增多，从而使收集的上清液体积减少。

表2 相同提取体系下杜仲叶粉末质量对杜仲叶总黄酮提取率的影响Table 2 Effect of Eucommia ulmoides leaves powder content on the yield of total flavonoids under the same extraction system

2.4 提取时间的影响

表3 相同提取体系下提取时间对杜仲叶总黄酮提取率的影响Table 3 Effect of extraction time on the yield of total flavonoids in Eucommia ulmoides leaves under the same extraction system

在总体系离子液体含量30%、杜仲叶粉末质量0.3 g左右、25 ℃振荡提取的提取体系下，随着提取时间的延长，提取液离心后上清液总黄酮浓度和杜仲叶总黄酮产率都逐步增加，但120 min后变化不是太明显，且收集的上清液体积虽然有增加的趋势，但也不是很显著。

3 结 论

显碱性的胆碱色氨酸离子液体溶液能较好地破坏杜仲叶细胞壁结构，使其中的溶质分子较易渗出，从而易于杜仲叶总黄酮的提取。同时基于单因素提取实验得出，提取温度、杜仲叶粉末量、提取时间会显著影响胆碱色氨酸离子液体溶液提取杜仲叶总黄酮产率；根据单因素最佳组合验证实验结果，在总体系离子液体含量30%，杜仲叶粉末量1 g左右55 ℃振荡提取90 min时的总黄酮提取产率最佳可达3.26%。