湿性年龄相关性黄斑变性出血患者血清lncRNA MEG3和miR-138表达水平与预后的关系

史亚波，朱 江，秦 兵，孙红艳

0 引言

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，ARMD)是一种老年人常见的退行性疾病，是致盲的主要原因之一。根据病理改变将ARMD分为干性和湿性，湿性ARMD多表现为视网膜纤维化、脉络膜出现新生血管且伴有出血状况[1]。ARMD出血是促使患者视力急剧下降和致盲的主要因素之一。目前临床上主要通过注射抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)进行治疗，可有效改善视力，但仍有部分患者的预后效果达不到预期[2]。因此，寻找有利于早期诊断，能准确评估预后且有效干预治疗的生物标志物十分重要。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类长度超过200nt且没有蛋白编码能力的RNA，可在转录前、转录后等多个水平发挥基因调控的作用，参与多种疾病的发生发展[3]。众所周知，lncRNA母系表达基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)在肿瘤细胞的增殖、分化方面研究较为广泛，被认为是治疗肿瘤的有效靶点，如垂体腺瘤[4]、小细胞肺癌[5]。微小RNA(Micro RNA，miRNA)是一类高度保守的内源性RNA，长度由21～25nt核苷酸组成，通过抑制靶基因mRNA的翻译或者降解mRNA，从而调控复杂的生物学过程[6]。miR-138是miRNA家族中的一员，也是近几年肿瘤疾病中研究的重点。有研究发现，年龄相关性白内障患者晶状体囊膜中miR-138呈高表达，miR-138可通过靶向负性调控SIRT1的表达，从而促进晶状体上皮细胞凋亡[7]。但miR-138在湿性ARMD出血疾病中的研究相对鲜少，而且lncRNA MEG3与miR-138之间的某种潜在的靶向关系也尚未报道。因此本研究选取2018-01/2021-06收治的湿性ARMD出血患者90例，研究湿性ARMD出血患者血清lncRNA MEG3、miR-138表达水平及其与患者预后的关系。

1 对象和方法

1.1对象前瞻性研究。选取2018-01/2021-06收治的湿性ARMD出血患者90例为观察组，所有患者均经过眼压、眼底彩照、光学相干断层扫描成像术(optical coherence tomography，OCT)等详细检查，并结合《实用眼科学》中有关湿性ARMD出血的相关诊断标准[8]。选择同期在我院进行健康体检人员78名作为对照组。纳入标准：(1)观察组患者均为湿性ARMD，首次确诊并选择在本院治疗患者；(2)对照组眼部各项指标检查正常；(3)资料齐全且依从性好。排除标准：(1)患有糖尿病、白内障、高度近视者；(2)患有心、肝、肾严重疾病者；(3)眼部曾进行过手术；(4)患有神经性疾病且不积极配合治疗者。本研究内容经患者及家属了解并签字同意，经本院医学伦理委员会批准，符合《赫尔辛基宣言》。

1.2方法

1.2.1主要仪器与试剂qRT-PCR仪购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，Trizol试剂购自于北京奥秘佳得医药科技有限公司，RNA逆转录试剂盒购自于艾博抗(上海)贸易有限公司，2×SYBR Green PCR Master Mix试剂盒购自于北京索莱宝科技有限公司，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2样品采集采集所有受试者入组后次日清晨的空腹静脉血3～5mL，在3 000r/min条件下高速离心10min，取样品上清液于EP管中，在-80℃下冷藏备用。

1.2.3qRT-PCR法检测血清lncRNAMEG3和miR-138表达水平在所有样品中加入Trizol试剂进行总RNA的提取，采用紫外分光光度计检验提取的RNA的纯度是否符合标准。严格按照RNA逆转录试剂盒的试验步骤将RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板，利用2×SYBR Green PCR Master Mix试剂盒进行qRT-PCR，PCR反应条件为95℃预变性10min，95℃变性15s、60℃退火60s、60℃延伸60s，共40个循环。lncRNA MEG3、miR-138的内参分别为GAPDH、RNU6B。采用2-ΔΔCT法计算lncRNA MEG3、miR-138的相对表达水平。引入序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.4观察组患者治疗及随访观察组患者注射雷珠单抗进行治疗，每月1次，共3次。治疗后随访3mo。预后良好：与治疗前相比，患者在接受治疗后3mo视力逐渐好转或者没有出现视力退化的情况；预后不良：患者视力逐渐退化[9]。

2 结果

2.1两组受试者一般资料比较两组受试者一般资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表2。

表2 两组受试者一般资料比较

2.2两组受试者血清lncRNAMEG3和miR-138表达水平比较与对照组相比，观察组患者血清lncRNA MEG3水平明显下降，而miR-138水平明显上升，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 两组受试者血清lncRNA MEG3和miR-138表达水平比较

2.3影响观察组患者预后的单因素分析观察组患者治疗后随访3mo，根据患者预后情况分为预后良好组61例，预后不良组29例。影响观察组患者预后的单因素分析结果见表4。与预后良好组相比，预后不良组患者血清lncRNA MEG3水平明显降低，而miR-138水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表4 影响观察组患者预后的单因素分析

2.4Pearson相关性分析lncRNAMEG3与miR-138关系Pearson相关性分析结果显示，lncRNA MEG3与miR-138呈负相关(r=-0.381，P<0.05)，见图1。

图1 lncRNA MEG3与miR-138的相关性。

2.5ROC曲线分析lncRNAMEG3和miR-138对预后不良患者的评估价值ROC曲线结果显示，血清lncRNA MEG3、miR-138表达水平对预后不良患者发生预后不良评估价值见图2，表5。

表5 ROC曲线分析lncRNA MEG3和miR-138对预后不良患者的评估价值

图2 lncRNA MEG3和miR-138对预后不良患者评估价值的ROC曲线。

2.6多因素Logistic回归分析影响湿性ARMD出血患者预后不良的因素以具有差异性的lncRNA MEG3、miR-138为自变量，以湿性ARMD出血患者是否发生预后不良为因变量进行多因素Logistic回归分析，以逐步向前法筛选变量，结果显示lncRNA MEG3是湿性ARMD出血患者预后不良的保护因素，miR-138是危险因素(P<0.05)，见表6。

表6 多因素Logistic回归分析影响湿性ARMD出血患者预后不良的因素

3 讨论

ARMD是45岁以上的老年人常患的一种致盲疾病，主要是由于黄斑区视网膜因衰老而发生的病变[10]。ARMD出血是该疾病患者致盲的主要原因之一，严重影响人们的正常生活。目前临床上主要是通过荧光素眼底血管造影和OCT检查确诊，但部分患者早期症状不明显，容易造成误诊和漏诊[11]。ARMD出血是多种因素导致的，其复杂的发病机制尚未清楚，因此，寻找有效便捷的分子标志物对患者预后状况的准确评估有重大意义。

近年来研究发现，lncRNA在眼部疾病中存在异常表达，是各种眼部疾病发生的重要影响因子[12]。lncRNA MEG3是定位于人类染色体14q32.3中的基因，在正常组织中普遍表达。Zhu等[13]研究发现，沉默lncRNA MEG3可阻止体内光诱导的视网膜变性和体外光诱导的光感受器细胞凋亡。Sun等[14]研究表明，lncRNA MEG3通过海绵化miR-7-5p而抑制miR-7-5p的表达，抑制视网膜色素上皮的去分化和ARMD的病理发展，在ARMD中作为保护因子存在，是ARMD的潜在治疗靶点。在本研究中，观察组较对照组患者血清lncRNA MEG3水平显著下降，且预后良好组患者血清lncRNA MEG3水平明显高于预后不良组。提示lncRNA MEG3水平降低可能参与ARDM出血的发生，且可能与患者预后不良有关。

多种miRNA参与ARMD的发病过程，氧化应激损伤、视网膜色素上皮细胞损伤及脉络膜新生血管形成是湿性ARMD发病机制的重要因素[15-16]。miR-138包括位于3号染色体的miR-138-1和16号染色体的miR-138-2，在机体组织中广泛存在[17]。陆博等[18]研究发现，miR-138在年龄相关性白内障的病理过程中表达水平升高。Qian等[19]研究发现，红景天通过对miR-138产生抑制作用并激活PI3K/AKT和AMPK通路来缓解高糖导致的视网膜色素上皮细胞系ARPE-19细胞损伤。结合本研究，观察组患者血清miR-138水平较对照组明显上升，且预后良好组患者血清miR-138水平明显低于预后不良组，提示miR-138水平升高可能与湿性ARMD出血的发生及预后不良有关。

ROC曲线结果显示，血清lncRNA MEG3水平对湿性ARMD出血患者发生预后不良评估价值的AUC为0.859，敏感度相对较高，提示血清lncRNA MEG3水平可作为预测湿性ARMD出血患者预后不良的指标之一。血清miR-138水平对湿性ARMD出血患者发生预后不良评估价值的AUC为0.828，特异性相对较高。另外，多因素Logistic回归分析显示lncRNA MEG3是湿性ARMD出血患者预后不良的保护因素，miR-138是湿性ARMD出血患者预后不良的危险因素。提示血清lncRNA MEG3对ARMA出血患者预后的评估具有较高价值，可能是治疗该疾病的有效分子靶点。miR-138有望成为评估该疾病预后的分子标志物，及时检测miR-138水平并做出相应的干预措施，对改善预后有十分重要的意义。

生物信息学miRcode网站显示，lncRNA MEG3与miR-138存在结合位点。且本研究Pearson相关性分析结果显示，lncRNA MEG3与miR-138呈负相关关系，提示两者在该疾病中可能存在某些机制调控，需要今后补充基础实验进行验证。

综上所述，血清lncRNA MEG3、miR-138在湿性ARMD出血患者中呈异常表达，且对湿性ARMD出血患者的预后不良具有一定的评估价值。总之，研究湿性ARMD出血疾病中lncRNA MEG3与miR-138的表达与预后的关系有助于我们了解该疾病的机制发展，但本研究仍存在一些缺点，如纳入患者相对少且仅对患者进行了3mo的随访，研究结果可能有偏差，未来将扩大样本量、延长随访时间，以验证结果，从而为湿性ARMD出血患者的治疗提供新思路。