牛繁殖性状候选基因研究进展

邵燕弟，蒋秋斐，封 元，王 瑜，张 娟，周子航，王卫振，禹保军，冯小芳，陈亚飞，顾亚玲

(1.宁夏大学农学院，银川 750021；2.宁夏畜牧工作站，银川 750021)

繁殖性状是牛经济性状的重要组成部分，提高牛群繁殖率是增加养殖业经济效益的关键环节。牛属于单胎动物，通常一胎产一犊，繁殖率低下。 牛的群体双胎遗传力和排卵遗传力分别为0.03和0.07，自然状态下的双胎率仅为0.15%～2.99%[1]。因此，提高牛的繁殖率成为现代畜牧工作者的关键任务，是国内外研究的热点。 Ealy等[2]根据过去25年完成的工作，发现接受体外胚胎生产的牛中只有27%能产下活牛。生殖性状表现出低到中等的遗传力，需要分子标记来加快这些具有经济价值的性状的遗传进化。近年来，采用胚胎移植等技术提高繁殖率，具有遗传选择研究进展慢、繁琐、成本高等问题。随着分子生物技术的发展，人们开始从基因水平上进行探索，为提高牛繁殖性状的研究提供了新思路。国内外运用各种分子方法研究与牛繁殖相关的基因，通过筛选关键候选基因、功能验证等来确定牛繁殖性状相关基因，以期提高牛繁殖率促进农牧业发展。作者主要对精液品质、卵泡发生、排卵、早期胚胎发育、产犊难易及产犊间隔相关候选基因进行了归纳总结，旨在为牛繁殖性状的遗传改良提供理论参考依据。

1 精液品质相关候选基因

动物的精液品质受多基因控制，遗传力较低。季节、年龄、遗传等都能影响精液品质。种公牛的精液品质是影响母牛受胎的主要因素之一。Bhakat等[3]通过研究年龄对种公牛精液品质的影响发现，随着年龄的增加精子活力降低，畸形率也有所增加。该部分将对促黄体素受体(luteinizing hormone receptor,LHR)基因和牛精子鞭毛2 (sperm flagella 2,SPEF2)基因在精液品质方面的研究进行归纳总结。

1.1 LHR基因

LHR属于糖蛋白激素受体亚家族[4]。马富龙等[5]通过研究LHR基因在牦牛不同发育阶段睾丸中的表达，发现睾丸组织中LHR可能在精子成熟过程中发挥作用。LHR基因内含子9发生A51703G及G51656T的突变，分别引起BfaⅠ酶切位点及HinfⅠ酶切位点多态性，通过关联分析发现，种公牛精液品质与LHR基因的多态性有关[6]。孙丽萍等[7]等通过研究144头中国荷斯坦牛和79头河南地方肉牛品种的多态性与精液品质之间的关系，发现LHR基因G51656T位点检测到TT和GT 2种基因型，且TT基因型精子密度显著高于GT基因型,对河南地方肉牛品种的精子密度影响显著，可作为影响牛精液品质的候选基因。此外，Sun等[8]对中国荷斯坦牛的研究发现，LHR基因A51703G位点AG基因型新鲜精子活力高于AA基因型和GG基因型。上述研究说明LHR基因在精子密度、精子活力等方面发挥着重要作用。

1.2 SPEF2基因

SPEF2基因，又称KPL2基因，位于20号染色体上。SPEF2基因在精子尾部的形成和发育中起重要作用。研究表明，SPEF2基因突变导致精子发生受损，出现尾部缺陷，并导致精子活力降低[9]。通过对中国荷斯坦公牛群体进行基因型检测分析，在SPEF2基因第1内含子筛选到1个单突变位点(g.11043C>T)，发现该位点与精子畸形率显著相关[10]。此外，Guo等[11]研究发现，SPEF2基因外显子20中的1个SNP(c.2851GOT)位于1个假定的外显子剪接增强子内，可能产生SPEF2-SV3(剪接变异体)，并与精液畸形率和解冻后冷冻保存精子的活力有关。 Sweett等[12]使用加权单步基因组BLUP法对265头杂交肉牛进行全基因组关联分析，以识别与精子活力相关的分子标记，结果发现，SPEF2基因与精子浓度、发育和运动有关。SPEF2基因在人及小鼠上的研究相对较多，后续可深入挖掘该基因在牛方面的研究。

2 卵泡发生、排卵相关候选基因

卵母细胞分泌诱导卵泡形成、促进颗粒细胞增殖、调节类固醇生成和维持发育中卵泡结构的信号[13]。 促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)通过垂体门静脉系统作用于垂体前叶，刺激垂体合成并释放促黄体激素(luteinizing hormone,LH)和促卵泡素(follicle-stimulating hormone,FSH)，在卵泡发生及排卵中发挥重要作用[14]。转化生长因子-β(TGF-β)超家族中的成员调控着早期卵泡的发生，其中，抗苗勒氏管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)存在于卵母细胞周围的颗粒细胞中，与原始卵泡重新聚集到卵泡发生的生长阶段有关[15]。TGF-β家族的骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic protein 15,BMP15)和生长分化因子9 (growth differentiation factor 9,GDF9)通过复杂的旁分泌信号过程直接诱导卵泡发育[16]，首先在初级卵泡内的卵母细胞中发现，且在排卵后仍存在于卵母细胞中[17-18]。

2.1 FSH和LH基因

FSH和LH均由垂体前叶释放，是对卵泡发生和排卵起重要作用的糖蛋白类激素[19]。α亚基为促性腺激素所共有，β亚基决定促性腺激素的生物学特异性[20-21]。Chu等[22]研究证明，LH信号可以控制卵巢中卵母细胞的成熟和排卵。Da等[23]研究表明，FSH刺激增加了非哺乳期荷斯坦牛活体采卵的中型卵泡数量和比例。此外，Zhang等[24]通过研究FSH对玻璃化冷冻卵巢移植物血供和卵泡存活的影响发现，在玻璃化冷冻保存卵巢时补充0.3 IU/mL FSH可增加小鼠卵巢移植物的血供和卵泡存活率。Xiao等[25]研究发现，当在牛体外受精培养液中添加5 mg/mL FSH和50 IU/mL LH时，牛体外受精胚胎卵裂率和囊胚率均显著高于对照组。朱芳贤等[26]研究不同剂量(22 AU和20 AU)FSH对文山牛超数排卵效果的影响发现，22 AU组的有效胚胎率高于20 AU组，表明FSH剂量是影响超数排卵效果的关键因素。以上研究表明，FSH和LH基因在动物卵泡发生及排卵过程中起着重要作用。

2.2 GnRH基因

GnRH是下丘脑分泌产生的激素，对动物生殖调控起重要作用。有研究表明，受单侧颗粒膜细胞瘤(GTCT)影响的母马具有攻击性行为，通过GnRH免疫对4只母马的卵巢大小、睾酮浓度及攻击性行为进行研究，结果表明，GnRH疫苗通过产生结合内源性GnRH的循环抗体来抑制卵巢活性[27]。结合的内源性GnRH不能与垂体前叶的受体结合，导致FSH和LH分泌减少。Liu等[28]为研究GnRH对2种低剂量(375和250 μg)前列腺素F2α(prostaglandin F2α,PGF2)诱导泌乳奶牛黄体溶解后排卵反应的影响，发现在2种低剂量PGF2α诱导的黄体完全溶解后，GnRH给药增加了排卵率。此外，Liu等[29]评估了人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)和GnRH对泌乳奶牛不同发情期排卵反应的影响，结果发现，在不同发情期hCG诱导的排卵均比GnRH诱导的晚，但是2种治疗在排卵率方面没有差异。 Bittar等[30]在产后17和20 d给荷斯坦奶牛施用2剂GnRH，成功诱导了泌乳24 d的奶牛排卵，且产后早期给予GnRH可诱导排卵而不影响子宫健康。

2.3 AMH基因

AMH是卵巢早期有腔卵泡的颗粒细胞合成分泌的一种糖蛋白激素，TGF-β超家族的一员。AMH水平与多个物种雌性动物的生殖力相关，因而，血液中AMH水平影响母牛繁殖性能的高低[31]。有研究表明，相比于野生小鼠，缺失AMH的小鼠能够募集更多的原始卵泡，表明AMH抑制了原始卵泡的募集[32]。Weenen等[33]为研究AMH在人类卵泡发生中的作用，通过人卵巢中AMH免疫染色表明AMH在初始和循环募集过程中的作用，结果证实了先前在大鼠和小鼠中的观察结果，即AMH在卵泡发生过程中发挥着重要作用。李树静等[34]为研究供体牛超排过程中阴道栓(CIDR)埋置、人工授精和胚胎回收3个时间外周血AMH浓度与荷斯坦青年奶牛体内胚胎生产效率的相关性，对96头荷斯坦青年奶牛进行超排处理,结果发现，外周血AMH浓度在一定程度可以反映供体牛超排的效果，可以作为供体牛(体况适中)筛选条件之一。此外，Nawaz等[35]为研究AMH的基因组遗传力及相关的基因组区域，使用Zoetis中密度面板对2 905头荷斯坦奶牛进行基因分型，通过全基因组关联分析评估AMH的基因组遗传率，结果显示，牛AMH与卵巢卵泡储备、生育力、寿命和超数排卵反应之间有着高遗传率。在辅助生产过程中，AMH可以作为家畜生育能力、超数排卵和卵巢疾病的潜在预测指标[36-37]。

2.4 GDF9和BMP15基因

GDF9和BMP15是TGF-β超家族的成员[38]，二者均是卵母细胞分泌的因子，对卵泡发育和排卵有显著影响，对控制雌性生殖中的卵巢功能起主导作用[39-40]。Alam等[41]研究了GDF9和BMP15对体外培养的牛卵母细胞-颗粒细胞复合体(OGCs)形成窦样结构的影响，从早期有腔卵泡中收集含有卵母细胞的OGCs，用于制备去卵细胞复合物(OXCs)和颗粒细胞复合物(GCs)，发现在不含GDF9和BMP15或仅含BMP15的OXCs和GCs中，生长颗粒细胞分化为成纤维细胞样细胞，而GDF9和BMP15的组合抑制了成纤维细胞样细胞的出现，结果表明，卵母细胞通过阻止颗粒细胞分化维持复杂的完整性，并通过GDF9和BMP15参与卵泡腔的形成。BMP15和GDF9能够通过受体与骨形成蛋白2型受体(bone morphogenetic protein receptor type 2,BMPR2)结合,进而调控下游代谢反应，研究发现，btacircRNA11396通过海绵吸附效应抑制miR-187的活性,促进BMPR2表达，抑制细胞凋亡，从而调节牛卵丘细胞的状态，影响卵泡发育[42]。通过原位杂交表明，BMP15基因在牛的初级卵泡和次级卵泡早期、颗粒细胞以及次级卵泡的晚期都有表达[43]。刘畅[44]研究发现，BMPR2是miR-375的直接靶基因,而BMPR2是BMP15和GDF9唯一且共同的Ⅱ型受体，因此推测miR-375调控BMP15和GDF9的相关通路,表明BMP15及GDF9对miR-375具有调控作用，从而影响牛卵丘细胞的增殖与凋亡。GDF9和BMP15在生殖系统中发挥着重要作用，尤其在卵泡发育方面。近几年，GDF9和BMP15在基因多态性与羊产羔数的关联分析的研究较多，如晁哲等[45]通过关联分析发现，海南黑山羊GDF9基因+2 541处发生的C/T突变与初胎产羔数显著相关，且TT基因型显著高于CC基因型。孙庆等[46]通过Sequenom MassARRAY SNP技术发现，鲁中肉羊GDF9基因G5位点不同基因型与初胎产羔数显著相关，结果可为产羔数性状的选育提供理论参考依据。GDF9和BMP15基因在牛上的研究相对较少，需要进一步研究。

3 早期胚胎发育及产犊难易相关候选基因

胚胎死亡率是牛生产系统中繁殖效率和盈利能力的主要影响因素。胚胎不能生长无疑会导致胚胎丢失，因此被认为是牛繁殖失败的重要原因[47]。早期胚胎发育对后期胚胎着床和妊娠至关重要[48]。良好的胚胎发育是顺利产犊的关键。产犊难易也是影响牛繁殖性能的一个重要指标。胎次、产犊季节、犊牛初生重等对产犊难易有显著影响。因而，预防难产、降低难产率显得格外重要。下面将从JY-1、尾型同源框2(caudal type homeobox 2,CDX2)基因对早期胚胎发育的调控作用及冠毛素2(pappalysin 2,PAPP-A2)基因对产犊的调控方面进行归纳。

3.1 JY-1基因

JY-1基因编码一种具有多个mRNA转录本的分泌蛋白，这些转录本含有相同的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)，但3′-UTR的长度不同。JY-1 mRNA和蛋白质是卵母细胞特异性的，可在整个卵泡发生过程中检测到。 母体来源的JY-1 mRNA存在于早期牛胚胎中，且是囊胚发育所必需的。因而，JY-1是一种卵母细胞表达基因，可调节牛早期胚胎的发育[49]。在卵母细胞体外成熟期间，JY-1蛋白的消耗有效地降低了卵丘细胞的扩张、MⅡ期卵母细胞百分比及早期胚胎卵裂的比例[50]。通过siRNA显微注射使受精卵JY-1基因敲除，降低了JY-1 mRNA和蛋白的表达，并显著降低了8-细胞、16-细胞和囊胚阶段的发育速率[49]。de Camargo等[51]对385头奈洛尔母牛JY-1基因的外显子1和外显子2进行了PCR测序研究，通过连锁不平衡分析发现Chr29：12 999T/A与早孕的发生有关。此外，de Camargo等[52]对20头无血缘关系的瘤牛和水牛的JY-1基因外显子区域进行了序列测定，与瘤牛序列相比，在水牛序列外显子3的编码区检测到胸腺嘧啶的插入，从而导致移码突变，改变了水牛蛋白的19个末端氨基酸，并提前产生了一个终止密码子，这一发现解释了瘤牛和水牛在卵泡发生、胚胎发育和双胞胎怀孕发生率方面的差异。以上结果表明，JY-1在受精后介导胚胎发育进程中具有重要作用。

3.2 CDX2基因

CDX2是尾部相关同源框转录因子基因家族的成员。CDX2在胚胎发育过程起维持胚胎生长、诱导细胞分化和器官形成的作用[53]。CDX2从桑椹胚阶段开始就对滋养外胚层起重要作用[54]。刘欣[55]在检测牛体外受精胚胎时发现，在早期胚胎发育各时期均有CDX2 mRNA表达，囊胚期的内细胞团和滋养层细胞中有CDX2蛋白的表达。使用牛滋养外胚层衍生的CT-1细胞系检测CDX2在牛滋养层基因调控网络中的作用，结果表明，CT-1细胞中的多个滋养层基因(FNT、HAND1、ASCL2和SOX15)受CDX2的调节[56]。为研究CDX2在内细胞团和滋养外胚层分化中的功能，利用RNA进行干扰使CDX2下调，将CDX2特异性短干扰RNA(siRNA)注射到牛受精卵中，结果发现，CDX2下调影响桑椹胚到胚泡阶段囊胚腔形成和细胞增殖的时间，表明CDX2对牛胚胎内细胞团和滋养外胚层谱系分化的早期发育和基因表达至关重要[57]。

3.3 PAPP-A2基因

PAPP-A2由妊娠相关血浆蛋白A2基因编码，是一种金属蛋白酶，特异性地裂解IGF结合蛋白5(IGFBP-5)，增加IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ的利用率[58]。PAPP-A2在胚胎生长发育中起重要作用，异常的PAPP-A2水平与先兆子痫、唐氏综合征、发育性髋关节发育不良等多种疾病存在相关性，但具体机制仍不清楚。 在荷斯坦牛中，在16号染色体上检测到一个与产犊难易有关的QTL，该QTL位于PAPP-A2基因区域[59]。Wickramasinghe等[60]对荷斯坦公牛的7个标签单核苷酸多态性进行了标记性状关联分析，发现3个SNPs在荷斯坦奶牛中处于强连锁不平衡状态，与产犊难易、生产寿命、产奶量和蛋白质产量呈显著正相关。 以上结果表明，PAPP-A2基因可作为牛繁殖相关的候选基因，在产犊难易方面发挥重要作用。

4 产犊间隔相关候选基因

产犊间隔又称胎间距，即2次产犊间的时间间隔，可以用来描述奶牛繁殖效率的指标之一。de Vries等[61]研究了佛罗里达和佐治亚州奶牛场1976—2002年间繁殖性能的变化趋势，发现平均产犊间隔由1976年的399 d增加到2000年的429 d。此外，Refsdal[62]为研究挪威牛繁殖性能的变化趋势，利用1985—2005年每年的牛计算出繁殖力指数，平均繁殖力指数没有明显的变化趋势，产犊间隔也基本稳定在12.4～12.6个月之间。Ogawa等[63]使用随机回归模型和重复性模型估计了日本黑牛产犊间隔的遗传参数，分析了36 178头奶牛的92 019个产犊间隔记录，得出随机回归模型估计遗传力为0.12～0.20，重复性模型估计遗传力为0.17。因此，产犊间隔的遗传力较低，今后可针对产犊间隔进行遗传改进。研究表明，唾液酸结合Ig样凝集素5(sialic acid binding ig like lectin 5,SIGLEC5)、CXC基序趋化因子受体1(C-X-C motif chemokine receptor 1,CXCR1)、叉头转录因子O1(forkhead box O1,FoxO1)等基因与产犊间隔相关[64-66]，可作为产犊间隔的潜在候选基因，为缩短产犊间隔，提高繁殖力提供参考依据。

4.1 SIGLEC5基因

SIGLEC5基因编码的蛋白质是Siglecs的CD33相关子集的成员，Siglecs是一个凝集素家族，属于免疫球蛋白超家族，识别糖蛋白的唾液酸残基[67]。利用干扰素刺激基因15(interferon stimulating gene 15,ISG15)在外周血中(总白细胞中)的表达水平能对自然发情奶牛做出较为准确的妊娠诊断，为早期妊娠诊断提供理论依据[68]。Puckowska等[64]通过测序和限制酶Msp 1消化鉴定了外显子3的新错义多态性(A>G)，使得SIGLEC5蛋白(R260Q)第260位氨基酸精氨酸被谷氨酸取代，结果表明，SIGLEC5 R260Q的多态性与奶牛的空怀天数、产犊间隔以及公牛产犊间隔的育种值有关，因而SIGLEC5基因外显子3中新的错义多态性A>G是荷斯坦-弗里斯牛繁殖性状(产犊间隔和空怀天数)的一个潜在的遗传标记。SIGLEC5基因在牛繁殖方面的相关研究很少，因此可作为牛繁殖性状的候选基因进一步研究。

4.2 CXCR1基因

CXCR1是只含1条肽链的糖蛋白，属紫红质样G蛋白偶联受体超家族成员。CXCR1基因定位于2号染色体，具有丰富多态性。王梦琦等[65]通过飞行时间质谱法检测865头荷斯坦牛CXCR1基因编码区，发现CXCR1-816 C>A位点对产犊间隔影响显著，AC基因型个体产犊间隔显著低于AA型个体。CXCR1基因CDS区SNP可作为缩短产犊间隔候选分子标记之一。Jecminkova等[69]通过对786头捷克弗莱维赫奶牛的表型数据与繁殖性状进行关联，虽然发现CXCR1 c.777C>G与产犊间隔等繁殖性状没有关联，但为后续的研究提供理论依据，目前CXCR1基因在产犊间隔方面的研究较少，后续可深入对该基因的研究。

4.3 FoxO1基因

FoxO1参与细胞凋亡、氧化应激和细胞分化[70-71]。FoxO1是第一个发现的FoxO转录因子家族成员。赵佳强等[66]在中国荷斯坦奶牛中发现FoxO1基因有CC、TT、CT 3个基因型,该基因不同基因型对奶牛产犊间隔、空怀期以及初产日龄这几个繁殖性状均有显著影响，发现CT基因型平均产犊间隔为470.24 d,显著少于TT基因型产犊间隔661 d，表明CT基因型奶牛要比TT基因有更好的繁殖性能。目前，有关大鼠、小鼠、黑猩猩、人和猪FoxO1基因的研究已有报道，但有关牛FoxO1基因的研究报道较少。以上研究表明，FoxO1基因对牛产犊间隔有影响，后续可深入研究牛FoxO1基因对牛繁殖性状的调控功能。

5 小 结

作者主要对牛繁殖性状及其相关基因(精液品质(LHR、SPEF2)、卵泡发生和排卵(FSH、LH、GnRH、AMH、GDF9、BPM15)、胚胎发育及产犊难易(JY-1、CDX2、PAPP-A2)、产犊间隔(SIGLEC5、CXCR1、FoxO1))进行了介绍，目前对这些基因作用机制的研究还不深入，因此对已确认功能的基因仍需进行深入研究，并不断探索与牛繁殖性状相关的新候选基因。牛的繁殖性状在遗传改良中占据重要地位,但是繁殖性状的遗传力较低，常规育种耗时且效果差。近年来，随着高通量技术不断发展，成本也逐渐降低，在全基因组范围内为牛繁殖性状的分子研究提供了新的思路。全基因组关联分析与多组学联合分析已广泛用于鉴定各物种相关性状的候选基因和分子标记，得到了较多新的候选基因和显著相关的SNP。目前，已经通过全基因组关联分析等方法筛选到一些与繁殖性状相关的候选基因，但是在各牛种中的结果不尽相同，在相同牛种中也有不同的结果，其原因为繁殖性状受微效多基因控制。今后需将各种方法联合使用，确定重叠基因，将重叠基因作为影响繁殖性状的候选基因，以期进一步提高牛繁殖率。