粪菌移植技术的研究进展及其应用

李元元，吴妍妍，张文举

(石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832000)

动物肠道内含有大量的微生物，如细菌、真菌、古菌等[1]。肠道微生物对宿主的健康至关重要，不仅可以改善宿主营养、调节代谢，还可以调控肠道上皮发育、诱导先天性免疫等，其功能相当于机体的一个重要“器官”[2]。肠道菌群失衡可导致许多疾病的发生，如腹泻、胃肠功能紊乱等[3]。粪菌移植(Fecal microbiotal transplantation,FMT)则可通过健康供体粪菌液中的功能菌群恢复患者正常肠道菌群结构达到治疗某种疾病的目的。我国医学家葛洪曾在《肘后备急方》中记载了利用人粪便悬液治愈食物中毒和重腹泻等疾病[4]；在《本草纲目》中李时珍也有使用粪菌移植治疗多种胃肠道疾病，如腹泻、呕吐、便秘等疾病的记载[5]。1958年，美国外科医生Eiseman 等[6]通过粪菌移植对患有严重伪膜性肠炎的4名患者进行治疗，并取得了良好疗效；之后的20年，粪菌移植一直未得到重视；直到1978年，难辨梭状芽胞杆菌感染(CDI)被认为是伪膜性肠炎的主要原因，并与抗生素的使用密切相关，于是粪菌移植又重新进入人类临床研究领域。随着粪菌移植技术的深入研究，此技术已被证实是治疗难辨梭状芽孢杆菌感染的一种安全有效的方法；同时越来越多的研究也表明，粪菌移植在其他胃肠道疾病治疗中也发挥着重要的作用[7]。近年来，随着粪菌移植技术在临床上的成功应用，以及在畜牧业抗生素滥用突出的背景下，人们开始尝试将粪菌移植应用到动物生产中，且其应用研究呈上升趋势，并取得了一定的进展。因此，本文就粪菌移植技术的研究新进展及其应用做一综述，以加强科研工作者对这一新技术的深入了解，并为今后深入研究粪菌移植提供新思路。

1 粪菌移植的实施过程

为确保粪菌移植技术的有效性，消除受体心理障碍，随着此技术的研究进展，其实施过程(供体选择、菌液制备和菌液移植等)正逐渐标准化。

1.1 粪菌移植供体的选择 粪菌移植类似于“器官”移植，存在着疾病传播的风险，因此必须对供体进行严格的感染性疾病的筛查，以确保粪菌移植的安全性和有效性[8]。粪菌移植的供体可以选择与受体关系密切的个体，如夫妻、父母、子女等，也可从健康的捐赠者中进行选择。近些年，粪菌移植在人类临床的应用越来越多，为确保治疗方案的标准化、临床实践的安全性和合理性等，2016年粪菌移植欧洲共识会议中来自10个国家的28名专家，对人类适应症、供体选择标准、菌液的制备以及移植的实施等给出指南[9]。在人类供体选择时，首先通过问卷形式对供体病史和危险因素进行排除；了解是否使用非法药物；近6个月是否有纹身、人体穿孔等行为；是否有胃肠道、新陈代谢和神经系统疾病；了解供体超重和肥胖情况；近3个月使用抗生素、免疫抑制剂，接受化疗情况。供体年龄优先选择小于60岁，若为受体亲密接触的健康伴侣，年龄范围可适当放宽。合适的 FMT 供体在捐赠前应至少提前4周进行血液和粪便检查，血液检查如巨细胞病毒、人类嗜 T 细胞病毒Ⅰ型及Ⅱ型抗体等；粪便检查如梭状芽胞杆菌、沙门菌、志贺菌等肠道病原体等；特殊情况下粪便检查还包括霍乱弧菌和李斯特菌、幽门螺杆菌粪便抗原、轮状病毒等[10]。

在动物研究应用中，胡军等[11]等根据我国猪养殖的生产实践和人类临床医学粪菌移植的操作标准，提出了猪的粪菌移植供体筛选的8个原则；通过对猪系谱调查和体型外貌进行观察、猪行为学观察和临床检查、猪血清学检测、猪粪便样品细菌和病毒检测等方法对供体指标进行检测。朱见深[12]在进行家禽鸡的粪菌移植前通过比较分析无特定病原体(Specific pathogen free,SPF)鸡和商品蛋鸡的粪便菌群与大肠埃希菌抗药性，对供体进行了筛选，确定将SPF鸡作为降低抗药性的理想供体。粪菌移植在人类临床上研究应用较多，近年来，粪菌移植在哺乳动物仔猪中也得到了广泛研究，而在反刍动物中并没有获得很好的开发应用，对供体选择的系统标准还未见相关报道。

1.2 粪菌液制备 FMT中粪便菌液的制备主要包括粪便稀释、过滤和保存等。将新鲜的粪便放入盛有无菌生理盐水(通常推荐用3～5倍体积)的已灭菌的容器中制成粪便悬液，用无菌纱布、过滤器等初步除去粪便悬液中大颗粒杂质，再用不同孔径的无菌不锈钢筛依次除去颗粒较小的杂质。然后对过滤后的粪便悬液进行离心，收集上清液，用无菌生理盐水重悬菌体沉淀制得粪便菌液。随后可将新鲜的粪便菌液进行移植，也可加入甘油(终浓度为100 g/L)在-80 ℃冻存，待使用时对粪便菌液进行复苏后再移植至受体胃肠道内[9-10]。在空气中均质或经过冻融循环，粪便微生物菌群存活率会有所降低，所以所有菌液制备过程中应减少在空气中暴露的时间且避免重复冷冻和解冻[13]。为提升菌液制备效率，使得微生物活性得以最大限度地保存，智能化粪菌分离系统已成功研发应用，此系统的开发实现了粪菌分离、提纯过程的智能化和标准化[14]。

1.3 粪菌液移植途径 目前，粪菌移植途径有通过胃镜下喷洒粪菌或者胃镜下留置鼻空肠管等方式进行中消化道移植；通过灌肠以及肠镜喷洒粪菌或者肠镜下留置置管，再进行注入粪菌途径的下消化道移植；近些年也有通过口服粪菌制剂冷冻胶囊来治疗溃疡性结肠炎的研究[15]。对于选择哪种菌液移植途径主要取决于患者个体情况、病变部位以及疾病的特点[16]。

Khan等[17]通过上消化道途径和下消化道途径对543例CDI复发患者进行FMT治疗比较分析，发现2种治疗途径效果无差异。在动物研究应用中，朱见深[12]通过泄殖腔接种和喷雾接种的形式给肠道几乎无菌的1日龄SPF雏鸡进行粪菌移植，利用16S rRNA基因高通量测序技术对受体雏鸡肠道菌群的发展变化进行了检测；张亚楠[18]通过灌服喂养的方式研究了粪菌移植对不同产蛋水平蛋鸡肠道菌群结构的影响；宋冰[19]通过一次性注射器从口部缓慢灌入盲肠菌液研究了菌群移植对家兔生产性能、盲肠微生态和免疫性能的影响；但对于哪种移植方法效果更佳，并未见相关报道。在猪的粪菌移植途径中，Hu等[20]综合考虑生产实际和可操作性，提出了在猪粪菌移植技术中采用直接灌服或将菌液添加于日粮中进行饲喂的建议。

2 粪菌移植技术的应用

2.1 粪菌移植在人类临床中的应用 近年来，随着对粪菌移植在人类临床应用中的研究的深入，发现粪菌移植不仅可治疗抗生素相关性腹泻、难辨梭状芽孢杆菌感染肠炎等肠道疾病，还可治疗自身免疫性疾病等非胃肠道疾病。Meighani等[21]对201例难治性艰难梭菌感染患者进行了FMT，其中20例同时患有炎症性肠病，发现FMT治疗12周时，炎症性肠病患者总缓解率为75%。Blanco[22]提出通过FMT改变肥胖症患者肠道菌群，对于肥胖症治疗具有潜在作用。赵会君等[23]对1名确诊孤独症5年余的患儿分别经胃镜、肠镜进行粪微生态制品注入，治疗后8周，患者睡眠障碍、情绪方面有明显改善，尤其是胃肠道症状(呃逆)显著缓解。Leshem等[24]研究发现，在患有心脏代谢综合征的患者中，肠道微生物菌群会发生改变，粪菌移植到无菌小鼠体内后，其心脏代谢表型也传递给无菌小鼠。粪菌移植在人类临床中的主要应用如图1所示。

图1 粪便微生物移植在人类临床上的应用

2.2 粪菌移植在畜禽生产中的研究应用 粪菌移植在哺乳动物如仔猪、兔，反刍动物如牛、羊，家禽如鸡等畜禽的生产研究中均有报道，其研究应用如表1所示。

表1 粪菌移植在畜禽生产中的研究应用

粪菌移植在畜禽疾病治疗中的确切机制尚不清晰，但通过粪菌移植可以使受体肠道菌群得到调节，使得有益微生物相对丰度增加、微生物群落多样性增加、恢复正常肠道菌群结构[25]；多项研究表明，肠道微生物在维持宿主健康方面发挥着重要作用，有益的肠道微生物不仅可以调节宿主肠道屏障功能还可以代谢产生有益的营养物质，而且重要的是这些微生物有助于调节局部或全身的免疫功能。有研究表明，粪菌移植可提高大肠埃希菌K88感染仔猪肠道中乳杆菌属及琥珀酸弧菌属等有益细菌的丰度，降低肠杆菌科及变形菌门相对丰度，改善了仔猪肠道形态，降低了肠道通透性；同时可调节仔猪肠道中的支链氨基酸、亚油酸代谢；另外，仔猪肠道黏膜中FoxO信号通路中与自噬相关的蛋白表达增加，与炎症反应相关的蛋白表达减少[26]。另有研究表明，粪菌移植可使仔猪结肠中普雷沃菌、毛螺旋菌科、瘤胃球菌等丰度增加，变形菌门、梭杆菌科、拟杆菌科、大肠埃希菌等有害菌群减少，且仔猪平均增重增加，腹泻率降低；受体仔猪肠黏膜sIgA+细胞的光密度、杯状细胞的数量增加，MUC2蛋白的相关表达增强；β-防御素2的蛋白表达及TLR2和TLR4的mRNA表达明显升高，表明FMT对受体的生长性能、肠屏障功能和先天免疫及调节肠道菌群有重要作用[27]。耿世杰[28]研究表明，粪菌移植可以显著缓解LPS 诱导的肠上皮损伤，改变肠道菌群功能及其代谢组。唐义梅[29]通过梅山猪粪便微生物移植处理长×大后备母猪，发现后备母猪的初情日龄提前，血清雌二醇浓度增加，促进了卵泡发育，并且长×大后备母猪粪便微生物区系向梅山猪转变。

吴兆海[30]将被动免疫成功犊牛粪菌液移植到被动免疫失败犊牛瘤胃中，发现粪菌移植组犊牛结肠黏膜Claudin-4基因和Occludin基因相对表达量，空肠Claudin-1蛋白、空肠和结肠Occludin蛋白表达量和结肠ZO-1蛋白表达量，各肠段黏膜IL-8基因表达量均显著高于被动免疫失败犊牛组；各肠段黏膜TLR-2、空肠黏膜IL-10基因表达量显著低于被动免疫失败犊牛；粪菌移植对被动免疫失败犊牛生长及健康状况有良好促进作用。Niederwerder[31]在对包括猪、狗、马以及家禽等在内的十几种动物利用粪菌移植治疗疾病并取得良好效果的基础上，得出粪菌移植可能是一种未被充分利用、应用范围广、价格低廉的改善动物健康和动物疾病治疗的方法。

3 展望

目前，粪菌移植在人类临床及畜禽生产中有着广泛的研究应用，同时还有很多需要解决的难题，如粪菌移植供体的选择、菌液制备、菌液移植途径、菌液剂量的选择等，这些过程系统且繁琐，其操作的复杂性和专业性可能制约着它的推广应用。在畜禽生产应用中，猪的粪菌移植操作指南已有文献报道[11]，但在牛、羊等反刍动物中鲜有提及，另外其疗效和安全性评估等问题尚未明确。因此，粪菌移植应用于畜牧生产研究时，应根据动物生理特性及需求，谨慎的制定出供体筛选标准，选择科学合理的移植途径，使得粪菌移植过程更加标准化、规范化，随后建立科学的安全评价体系。研究表明，粪便中微生物数量十分庞大，但目前对它们的认知十分有限，其与宿主之间的相互作用机制尚未完全明确，随着以肠道菌群为靶点的相关疾病防治的深入研究，针对不同的个体需求或不同疾病，提升粪菌移植的针对性，实现粪菌移植向菌群移植的转变，通过多组学联合分析，探索其防治疾病的机制，可以为粪菌移植治疗人类和动物相关疾病进一步深入研究提供重要指导方向[32]。