虾肝肠胞虫的检测与控制技术研究进展

曹海鹏，夏婷婷，许 拉，盖春蕾

( 1.上海海洋大学 国家水生动物病原库，上海水产养殖工程技术研究中心，上海 201306； 2. 山东省海洋生物研究院，山东省海水养殖病害防治重点实验室，山东 青岛 266104 )

虾肝肠胞虫(Enterocytozoonhepatopenaei)，又名“肠道上皮细胞孢子虫”，于2003年被Chayaburakul等[1]首次发现，2009年由Tourtip等[2]从生长缓慢的斑节对虾(Penaeusmonodon)中分离并命名，主要感染斑节对虾、凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)等主要养殖虾类，除了长期肆虐印度、韩国、泰国等[3-5]多个国家的对虾养殖外，对我国对虾养殖业和食品安全也造成了威胁。2013年，我国养殖凡纳滨对虾首次检出虾肝肠胞虫，随后在江苏、山东、辽宁等地[6-9]的养殖对虾中也出现了不同程度的虾肝肠胞虫感染。因此，为降低虾肝肠胞虫对对虾养殖和食品安全的危害，建立高效实用的虾肝肠胞虫的检测与控制技术具有重要意义和应用价值。目前，虾肝肠胞虫的检测与控制技术研究取得了较大的进展，如建立了虾肝肠胞虫的组织学检测技术、分子生物学检测技术，探索了虾肝肠胞虫的控制技术。鉴此，笔者在简述虾肝肠胞虫的生物学特征的基础上，概述了虾肝肠胞虫的国内外最新检测与控制技术研究现状，并根据虾肝肠胞虫现有检测与控制技术研究的不足对未来的研究方向进行展望，旨在为虾肝肠胞虫的检测与控制提供参考。

1 虾肝肠胞虫的生物学特征

虾肝肠胞虫是一种细胞内寄生的微孢子虫，具有危害养殖生产的4个生物学特征：(1)生活史简单。虾肝肠胞虫的生活史分为孢子期、增殖期和孢子繁殖期3个阶段[9]，不需要中间宿主[10]，且周期短，整个过程仅为5～11 d。(2)感染机制复杂。虾肝肠胞虫对宿主细胞的感染过程包括孢子激活、发芽、孢原质侵入宿主细胞，在感染宿主细胞过程中会发生孢子壁弯曲与突起、极管的解螺旋与弹出、孢原质注入宿主细胞等现象[2,11-16]，也存在多种与黏附、侵染、调节细胞周期和免疫反应等相关的蛋白，如孢壁蛋白SWP7、多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶12、钙黏蛋白等[17]。(3)传播途径多样。虾肝肠胞虫的传播途径包括垂直传播和水平传播。相关研究证实[10,18-20]，感染虾肝肠胞虫的亲虾孵出的无节幼体、溞状Ⅰ期和Ⅱ期幼体中均能检出虾肝肠胞虫；健康虾摄食携带虾肝肠胞虫的病虾，或与病虾同居，或生活在含虾肝肠胞虫的养殖环境中均能被虾肝肠胞虫感染。(4)早期感染临床症状不明显[21]。虾肝肠胞虫通过肝胰脏的小管上皮细胞对宿主进行慢性感染，抑制机体内铁蛋白和小分子GTP酶Rab11A等免疫因子，使机体生长缓慢[22-23]，免疫力降低[17]，继发弧菌感染[24]。只有在机体生长发育后期才会出现壳软、中肠空、肝胰腺变色并有中度坏死的小管从基底膜脱离等明显症状[25]。

2 虾肝肠胞虫的检测技术研究现状

2.1 组织学检测技术

组织学检测是通过对组织进行石蜡切片、染色，然后在显微镜下观察病原的方法[26]，具有直观、成本低等优点，但也存在组织颜色干扰，检出率不高等缺陷[27]。目前，为了克服组织学检测方法的缺陷，相关研究创新了组织中虾肝肠胞虫染色方法。常晓晴等[28]比较了苏木精—伊红染色法、甲苯胺蓝染色法、爱显蓝—雪夫染色法、马松染色法、伟郝夫范吉森染色法、普鲁士蓝染色法、劳克坚牢蓝染色法和天狼猩红染色法等8种染色方法对组织内虾肝肠胞虫的染色效果，发现马松染色法十分适用于组织内的虾肝肠胞虫染色。Zhao等[29]采用荧光染色法将钙荧光白作为染色剂检测组织样品中虾肝肠胞虫的孢子，证实钙荧光白不会污染宿主组织，能够显示明显的蓝白色荧光，结果清晰，便于观察，可作为一种无创、非致死的虾肝肠胞虫孢子观察方法。

2.2 巢式PCR检测技术

巢式PCR通过两套引物，进行两轮PCR反应，其中以第一轮PCR反应的产物作为第二轮反应的模板，最终扩增出完整的目的DNA片段，具有特异性强的优点[30]，但二次扩增会使交叉污染的几率增大，造成假阳性结果[27]。目前，国内外学者对虾肝肠胞虫巢式PCR检测技术已开展了相关研究。Tangprasittipap等[31]根据虾肝肠胞虫核糖体小亚基基因(SSU rRNA)序列设计引物建立了虾肝肠胞虫的巢式SSU-PCR检测技术，能够检测到106拷贝/μL以上的模板。Jaroenlak等[32]根据虾肝肠胞虫孢壁蛋白质SWP序列设计建立了虾肝肠胞虫的巢式SWP-PCR检测技术，最低能够检测的质粒模板为104拷贝/μL，与SSU-PCR方法相比，新的SWP-PCR检测方法与密切相关的微孢子虫的DNA不发生交叉反应，特异性更高。叶键等[33]采用18S-PCR、SSU-PCR和SWP-PCR 3种方法对凡纳滨对虾、卤虫和水样中虾肝肠胞虫进行检测，结果显示，虽然在第一轮扩增中18S-PCR的灵敏度高于另外两种巢式PCR，但在第二轮巢式PCR扩增中，SWP-PCR检测技术的灵敏性更高，特异性更好，更适用于生物饵料、环境样本中虾肝肠胞虫的检测。

2.3 实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR是在DNA扩增反应中加入荧光染料，随着反应的进行，这种染料的荧光强度会不断增强，从而可以对反应中的DNA进行定量[34]，具有实时、快速等优点，但随着DNA浓度的降低，其检测准确性也随之降低[27]。目前，实时荧光定量PCR检测技术为样品中虾肝肠胞虫的检测提供了有力的工具。Liu等[35]建立了虾肝肠胞虫的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测技术，显著提高了虾肝肠胞虫的检测灵敏度，检测限低至40拷贝/μL。宋增磊等[36]通过将基于TaqMan实时荧光定量PCR的虾肝肠胞虫检测进行并样分析，发现国际标准推荐的5∶1并样检测可以扩展到50∶1，两者诊断特异性和诊断灵敏度相似，可为7%以上感染率的样本提供兼顾准确性和低成本的检测，显著提高了虾肝肠胞虫的检测效率。Piamsomboon等[37]开发了一种基于β-微管蛋白基因序列的实时荧光定量PCR方法，可对虾肝肠胞虫进行特异性定量，对虾和粪便样本中虾肝肠胞虫的检测限达到了103～105拷贝/μL，对卤虫和污染水体中虾肝肠胞虫的检测限达到了10-2～100拷贝/μL。

2.4 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增是Notomi等[38]在2000年建立的新型核酸扩增法，不需要昂贵的设备，可在等温条件下扩增核酸，具有检测成本低、易于在生产中大规模应用等优点，但对引物设计要求较高，检测过程容易出现气溶胶污染[27]。目前，国内外学者对虾肝肠胞虫的环介导等温扩增检测技术研究做了大量工作。Karthikeyan等[39]建立了虾肝肠胞虫的实时定量环介导等温扩增检测方法，检测范围可达到10-3～10-1拷贝/μL。Sathish Kumar等[40]建立了虾肝肠胞虫的SYBR Green Ⅰ可视化环介导等温扩增检测方法，检测限低至10拷贝/μL，而且还设计了一种简便、廉价的密闭管扩增法，即用注射器和针头向扩增后的小瓶中加入SYBR Green Ⅰ染料，避免了气溶胶污染。孙妍等[41]基于虾肝肠胞虫的核糖体小亚基基因设计6个引物，建立了新型环介导等温扩增方法，35～40 min内即可完成样品的检测，且与对虾常见病毒均无交叉反应。陈进会等[42]建立了虾肝肠胞虫环介导等温扩增检测方法，将检测时间缩短到30 min内，与实时荧光定量PCR检测结果符合率达到97%。Ma等[43]利用绿色荧光核酸染料SYTO-16建立了环介导等温扩增检测虾肝肠胞虫的方法，灵敏度达到了10拷贝/μL，与实时荧光定量PCR检测结果的符合率达到96.9%，在不需要特殊设备的情况下，20 min内完成分析。

3 虾肝肠胞虫的控制技术研究现状

3.1 生态控制技术

生态控制技术是依据宿主自身防御系统的抗寄生虫原理，人为调控宿主、寄生虫和水体环境三者之间的关系，改善宿主赖以生存的水域环境，诱导宿主启动自身防御系统，增强宿主抗寄生虫感染的能力，有效抑制寄生虫的侵袭，是控制寄生虫的有效手段[44]。Aldama-Cano等[13]研究发现，虾肝肠胞虫的孢子在-20 ℃下处理2 h后可被100%灭活。丁慧昕等[45]进一步用携带虾肝肠胞虫的鲜活病虾和-20 ℃冷冻病虾的肝胰腺组织投喂健康凡纳滨对虾，发现冰冻病虾肝胰腺投喂组的阳性检出率为12.5%，而鲜活病虾肝胰腺投喂组的阳性检出率为45.8%，证实-20 ℃冻存鲜活饵料使其携带的虾肝肠胞虫丧失了侵染性。因此，将鲜活饵料在-20 ℃冻存2 h以上，减少和清除其携带虾肝肠胞虫的生物量，被认为是减少虾肝肠胞虫感染的良好策略。

3.2 免疫控制技术

免疫增强剂是具有促进或诱发宿主机体防御反应，增强宿主机体抗病能力的一类物质[44]。近年来，微生物制剂、植物提取物等免疫增强剂被证实能够增强机体免疫水平，有效控制虾肠肝肠胞虫的感染。练小军等[46]试验研究表明，在饲料中添加假交替单胞菌(Pseudoalteromonassp.)KL-3 2010和微小杆菌(Exiguobacteriumsp.) KL-C2 2014能够增强携带虾肝肠胞虫的凡纳滨对虾血清中的超氧化物歧化酶、过氧化物酶等非特异性免疫酶的活性，提高虾的生长率和存活率。Tang等[19-47]调查发现，在凡纳滨对虾养殖过程中使用芽孢杆菌、乳酸杆菌等益生菌或应用柠檬、姜、糖棕、黑吉豆等植物天然提取物能够有效降低虾肝肠胞虫引起的白便综合征的发生。这些研究为虾肝肠胞虫免疫控制技术的建立奠定了良好的科学基础。

3.3 药物控制技术

药物控制技术是利用杀驱虫药物控制寄生虫的方法[44]。目前，虽然养殖生产上仍然缺少高效杀灭虾肝肠胞虫的药物，但虾肝肠胞虫的药物控制技术研究仍然取得了一定的进展。Aldama-Cano等[13]观察了次氯酸钙、福尔马林、高锰酸钾对虾肝肠胞虫的抑制效果，发现15 mg/L高锰酸钾能够完全抑制虾肝肠胞虫极管的弹出而使其丧失活性。赵若恒[48]开展了17种虾肝肠胞虫潜在控制药物的效果评价，筛选出4种能降低凡纳滨对虾体内虾肝肠胞虫携带量的药物。这些研究为养殖生产上虾肝肠胞虫的药物控制技术的建立奠定了基础。

4 展 望

目前，虽然国内外关于虾肝肠胞虫的检测与控制技术研究取得了显著的进展，但仍存在一些问题，具体体现在以下方面：(1)组织学检测法对虾肝肠胞虫的检出率低，费时费力，敏感性不高；(2)PCR方法不适用于现场检测，且会出现DNA交叉污染的情况，影响检测结果；(3)环介导等温扩增技术因其环引物的非特异性配对会导致假阳性，影响其检测结果的准确性。(4)生产实践中虾肝肠胞虫的控制以预防为主，严重缺乏虾肝肠胞虫的有效药物治疗技术。鉴此，应结合现代科学技术开发出针对虾肝肠胞虫的高效、灵敏、低成本且适用于现场使用的检测方法，如寻找虾肝肠胞虫特异性抗原，发展虾肝肠胞虫的免疫学检测技术；将免疫学检测技术与染色标记法结合，提高虾肝肠胞虫检测的特异性和敏感性[49]；将环介导等温扩增技术与基因芯片技术结合，实现虾肝肠胞虫的高通量检测[50]；开发用于快速检测虾肝肠胞虫的胶体金试剂条[51]。此外，还要借助分子生物学、生物信息学、寄生虫学、免疫学等领域的新理论与新技术，继续筛选和鉴定虾肝肠胞虫侵染宿主细胞的关键蛋白，阐明能与之结合的宿主细胞表面受体，在此基础上加快虾肝肠胞虫侵染宿主细胞关键蛋白的靶向抑制药物和虾肝肠胞虫疫苗的研发，切实推进虾肝肠胞虫有效控制药物的商品化进程。