高效液相色谱法测定美洛昔康咀嚼片中美洛昔康的含量

张华英，闻 亚，郑 琴，王以跃，谢等龙

（浙江海正动物保健品有限公司，浙江 杭州 311400）

美洛昔康（Meloxicam）是一种烯醇类非甾体类抗炎药，作为世界上第一种选择性抑制环氧化酶-2（COX-2）抑制剂，美洛昔康具有良好的抗炎、镇痛和解热作用，它也是目前众多获批的用于犬临床的非甾体抗炎药中的一种，美洛昔康在犬上有多种临床给药途径，目前在欧洲批准的有美洛昔康片剂和口服混悬液。本文所研究的美洛昔康咀嚼片，具有适口性好、犬用药顺应性高等优点，可用于缓解犬急性和慢性肌肉骨骼疾病引起的炎症和疼痛。为了建立美洛昔康咀嚼片中美洛昔康的含量检测方法，依据咀嚼片的特性，排除紫外可见分光光度法和电化学法，最终选择高效液相色谱法，成功建立了一种高效、准确、重现性好、灵敏度高的美洛昔康含量测定方法。

1 仪器与试药

1.1 仪 器Agilent 1260高效液相色谱仪（DAD检测器），德国塞多利斯电子分析天平（感量0.00001g），KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），超纯水仪（Milli-Q Advantage A10）。

1.2 试验药品甲醇（色谱纯、TEDIA），异丙醇（色谱纯、TEDIA），磷酸氢二铵（分析纯、科密欧），美洛昔康对照品（EP、Y0001080），美洛昔康咀嚼片（浙江海正动物保健品有限公司），批号分别为：P1505001A、P1505002A、P1505003A，规格为每片含美洛昔康1mg。

2 方法与结果

2.1 色谱条件采用Welch Xtimate C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；以磷酸氢二铵溶液-甲醇-异丙醇（64：32：4）混合溶液为流动相；流速为1.0mL/min；进样量为20μL；检测波长为254nm。典型色谱图（见图1）：

图1 美洛昔康咀嚼片含量典型色谱图

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品溶液的配制 精密称取美洛昔康对照品12mg，置25mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取5mL，置50mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，得到对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的配制 取本品20片，称定总重，用研钵将片研磨成均匀粉末。精密称取粉末适量（约相当于美洛昔康1.2mg），置25mL量瓶中，加流动相超声处理15min，并用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3 供试品溶液的测定按照2.1的色谱条件和2.2的溶液配制方法，将对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，按外标法以峰面积计算，即得美洛昔康的含量。

2.4 线性关系考察配制约含美洛昔康450 μg/mL的线性储备溶液，取线性储备溶液适量，用稀释剂定容，制成浓度为22.5、33.75、45.0、56.25、67.5μg/mL的美洛昔康线性溶液，每个浓度点重复进样2次，按照2.1的色谱条件进行测定。以美洛昔康对照品浓度为横坐标（x），以相应浓度测得的平均峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线。得到线性方程为y=47607x-8.762，相关系数为1，y轴截距占100%浓度峰面积的0.41%。说明美洛昔康在22.5～67.5μg/mL浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。线性结果（见图2）：

图2 美洛昔康线性关系图

2.5 准确度试验取线性储备溶液适量，分别加入到空白辅料中，用稀释剂定容，制成浓度为22.5、45.0、67.5μg/mL的准确度溶液，每个浓度配制三份平行样，按照2.1的色谱条件进行测定。结果（见表1），三个浓度的回收率分别为101.0%、101.5%和100.6%，RSD值分别为0.3%、0.0%和0.4%，美洛昔康回收率良好。

表1 美洛昔康准确度结果

2.6 重复性试验按照2.1的色谱条件和2.2的溶液配制方法，每个批次样品配制6份样品溶液，依次进样检测，并记录峰面积。结果（见表2），各批次样品的RSD在0.4%～0.9%，重复性较好。

表2 美洛昔康重复性结果

2.7 中间精密度试验中间精密度试验由另外一名实验员用不同HPLC系统、不同色谱柱在不同日期采用与“重复性”试验中相同批号的成品药来进行检测。实验员A，使用Agilent 1260高效液相色谱仪，配Welch Xtimate C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；实验员B，使用Waters e2695高效液相色谱仪，配Waters Symmetry C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）。结果（见表3），各批次样品的RSD在0.3%～1.0%，中间精密度较好。

表3 美洛昔康中间精密度结果

2.8 稳定性考察按2.2配制对照品溶液和供试品溶液，分别于25℃放置0、1、2、3d，每天用新配制的对照品溶液计算美洛昔康的含量。取20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，以美洛昔康含量与最初值比较。结果（见表4），差值在0.17%～0.65%，小于2.0%。因此对照品溶液和供试品溶液在室温密封条件下，3d内稳定。

表4 对照品溶液和供试品溶液稳定性结果

2.9 耐用性考察取P1505001A批次样品，按照2.1的色谱条件和2.2的溶液配制方法，配制2份平行样进行耐用性试验，考察流速、柱温、波长及流动相比例对含量测定的影响。结果（见表5），各条件下美洛昔康含量与正常条件结果的差值均小于2.0%，耐用性良好，对含量测定结果无影响。

表5 美洛昔康耐用性结果

3 讨论与结果

3.1 检测波长的确定取美洛昔康对照品溶液、空白辅料溶液和供试品溶液，使用DAD检测器进行全波长扫描。美洛昔康在254nm和270nm处均有较大吸收。因空白辅料溶液在270nm处有明显吸收峰，会干扰主成分的分析，同时参考美洛昔康片国家药品标准WS1-（X-332-2）-2003含量检测方法中规定的波长254nm，故确定254nm为美洛昔康咀嚼片含量测定的波长。

3.2 稀释剂的确定许多文献报道二甲基甲酰胺可用于溶解美洛昔康对照品。二甲基甲酰胺作为助溶剂，对加快美洛昔康溶解，改善色谱峰型，平稳基线有一定作用，但二甲基甲酰胺作为一种特殊的溶剂，会对色谱柱造成损伤，进而降低色谱柱的柱效及理论塔板数，不利于检测任务的长期重复进行。参考美洛昔康注射液（农业部公告1296号）中采用0.2%磷酸氢二铵溶液600mL和甲醇-异丙醇（65：10）400mL混合溶液为稀释剂，通过对不同比例稀释剂的选择和比对，最终确定采用磷酸氢二铵溶液-甲醇-异丙醇（64：32：4）为稀释剂，结果显示其对美洛昔康溶解性能良好，得到的峰信号强度比以二甲基甲酰胺为溶剂信号强，纯度高，色谱峰峰形对称；对仪器和色谱柱无污染和损坏。最终建立的美洛昔康咀嚼片含量测定方法简便、准确、重现性好、灵敏度高。