基层非洲猪瘟荧光定量PCR检测技术研究

文│黄丽非 李桂花 秦桂清（广西壮族自治区崇左市动物疫病预防控制中心）

2018—2019年，非洲猪瘟病毒导致我国养猪业严重亏损，尤其是采用传统养殖模式的中小型猪场。当猪只感染这种外来病毒时，临床表现多样，有急性型、亚急性型、慢性型，该病毒传染性很强，传播方式有直接接触、间接接触和蜱虫叮咬。因此，非洲猪瘟在我国被列为一类动物疫病。荧光定量PCR是一种灵敏度高、特异性强、便捷快速的检测技术。其反应是在PCR反应的基础上添加含有荧光因子的特异性探针，再利用具有热稳定性的DNA聚合酶切断探针，释放荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，因此荧光信号的强弱代表模版DNA的扩增量。目前我国主要使用该方法检测非洲猪瘟病毒，该方法也是OIE国际贸易指定试验方法。

为切实做好非洲猪瘟防控工作，我国正逐步完善基层动物疫病防控基础设施建设，要求各县（市、区）建设病原学PCR实验室，以及各屠宰企业设立非洲猪瘟实验室，开展非洲猪瘟检测工作。由于各方面的原因，县级和屠宰企业非洲猪瘟实验室条件参差不齐，包括实验室布局、仪器设备、检测环境、实验室检测人员等方面。广西壮族自治区崇左市地处边境与越南接壤，7个县（市、区）中就有4个边境县，非洲猪瘟防控形势复杂多变，因此，当前非洲猪瘟防控工作的一项重要任务就是规范开展非洲猪瘟荧光定量PCR检测，提高检测结果的准确性和可信度。目前，崇左市获得广西壮族自治区农业农村厅在授权范围内开展非洲猪瘟检测业务的有市级兽医实验室1个、县级兽医实验室7个、屠宰企业非洲猪瘟实验室7个和养殖企业非洲猪瘟实验室5个，现根据实地调查中发现的问题及实验室工作经验，简单论述如何提高基层非洲猪瘟实验室荧光定量PCR检测技术。

一、规范实验室条件

实验室存在的主要问题有实验室功能区设置不合理、人员流向不合理、物品流向不合理、未配备生物安全柜等。建设规范的非洲猪瘟实验室相匹配的硬件要求主要有以下两点。

1.实验室功能分区。设置不少于3个基本的实验室功能分区，包括样品处理区、试剂储存和准备区、扩增和产物分析区。实现各工作区域之间的单向流通，形成单向气流、物流、人流，避免各区域相互干扰，减少气溶胶污染。

2.配备必要的仪器设备。为满足基本荧光PCR检测，实验室至少应配备的仪器设备有荧光PCR仪、二级生物安全柜、高压灭菌器、离心机、水浴锅、微量移液器、冰箱/冰柜、紫外灯和空调等。各类仪器设备应严格按照操作规程进行维护，保证其在规定参数内正常运行。根据职能所需，在基本满足实验室仪器设备要求的条件上应有所增加，如配备核酸提取仪、组织破碎仪、低温离心机、电脑、打印机、洗眼设施、自动水开关等。此外，一些使用频率比较高的仪器设备如荧光PCR仪可以多购置一套以备不时之需。

二、管控样品和试剂

1.做好样品管控。采样过程应遵循无菌操作原则，选择合理的采样方法避免交叉污染，同时做好样品编号与采样记录。全血样品暂时放4℃冰箱保存，血清样品放-20℃冻存，PCR检测用的样品需尽可能新鲜并低温保存。所采集的样品以最快最直接的方式送往实验室，如果样品能在24小时内送达，则可以放于4℃左右的容器中运送。样品送达实验室后应做好登记，尽快进行检测，48小时内无法开展检测或需要留样的应-20℃冷冻保存。

2.严格管控试剂。使用的检测试剂要符合农业农村部相关要求，按照试剂盒要求妥善保存。试剂存放时温度偏高不仅容易挥发还导致产品有效活性降低，非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂通常需要保存在-20℃的环境中，并在试剂有效期内使用。如果单次实验检测数量较少且不经常检测时，建议将试剂进行小体积分装后-20℃存放，因为反复冻融也会导致试剂活性下降。分装试剂也要遵循无菌操作原则，避开PCR产物扩增区，在洁净的生物安全柜内使用已灭菌消毒的耗材开展分装操作，避免试剂被污染。分装试剂应做好相关标记，如名称、时间、含量等，方便准确使用。推荐有条件的非洲猪瘟实验室使用加长带滤芯的枪头，可以在一定程度上规避核酸交叉污染的风险。不同试剂厂家生产的非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂盒检测程序与扩增循环会略有不同，应严格按照试剂使用说明书的要求进行操作。可以根据不同的对象和要求对检测样品进行混样检测，但混样比例不宜过高，容易出现因被检样品核酸浓度小于最低检测限值而出现假阴性的结果。

三、提高检测技术人员素质

不同机构性质的非洲猪瘟检测实验室对检测技术人员的学历及人员数量要求有所不同，要求至少具备大学专科以上兽医相关专业技术人员不少于2名。同时建立人员培训及考核制度，检测人员应经过相关法律、法规、实验室管理制度、实验室生物安全防护、检测技术规范、实验操作技能、仪器设备使用和维护等相关培训，且考核合格后再上岗。定期对实验室检测人员进行考核、培训和检测能力比对，也可选择参加更高级别的实验室培训或跟班学习，全面提升检测人员的检测技能。

四、强化实验室管理

1.加强实验室指导工作。按照相关文件要求，市级、县级疫控系统兽医实验要充分发挥示范带头作用，开展非洲猪瘟病毒检测项目，完善质量手册、管理手册有关内容，规范实验操作流程，做好管理台账等各项工作。各检测室充分利用样品比对、仪器比对、抽样复核等检测实验，强化、细化实验室检测技术员的操作能力，提高检测精准度，避免因操作不规范而导致的污染和结果偏差。养殖企业及屠宰企业开展非洲猪瘟检测必须获得省级部门授权，实验室条件、设施设备、人员等按文件规定配备，同样对检测人员专业素质有要求。省级实验室应加强对市级、县级、养殖企业及屠宰企业实验室的指导、督导和培训工作，定期开展检测能力比对实验，确保辖区范围内的非洲猪瘟实验室都能准确、可靠的给出实验结果。

2.实验室日常消毒与通风。检测实验操作前后都要先对环境进行消毒灭菌，去除环境中可能存在的核酸污染因子。检测操作前，打开紫外线灯照射整个操作空间20分钟左右。检测操作过程中应把使用后的枪头打入盛有一定量有效消毒剂的烧杯中。检测操作完成后要及时清理操作台面，选择合适的消毒药品进行清洁，可以是碱类、氯化物、酚化合物等，待环境干燥后再打开紫外线灯照射半个小时。实验室废弃物离开实验室前需经高压灭菌处理，再进行下一步无害化处理，避免污染环境。很多基层实验室没有达到负压的检测条件，为减少气溶胶污染，需要在消毒后定期给实验室通风换气。

五、结语

目前用于非洲猪瘟检测的主要方法是荧光定量PCR、普通PCR法、核酸等温扩增法、ELSIA法、病毒分离法、荧光抗体法等多种方法，其中荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高，更适合开展快速检测实验，因此，在非洲猪瘟诊断和监测工作中普遍使用荧光定量PCR检测方法。由于部分县级兽医实验室、养殖企业和生猪屠宰企业接触实验室病原学检测比较晚，非洲猪瘟实验室建设时间较为仓促，易出现实验室布局不合理、生物安全方面考虑不够周全等问题，因此，还需进一步加强管理、强化培训和规范检测操作，以整体提升非洲猪瘟检测技术，让荧光定量PCR检测方法在非洲猪瘟防控工作中发挥重要的作用。