基于声表面波-气相色谱联用技术快速分析麝香中的麝香酮*

陆艳艳 沈刚 王剑波 朱宏伟 赵军宁† 郝俊杰 何世堂†

(1 中国科学院声学研究所北京 100190）

(2 四川省中医药科学院成都 610041）

0 引言

麝香是一味沿用至今的稀贵中药材，为鹿科马麝、林麝或原麝雄体香囊中的干燥分泌物。麝香含有大环化合物如麝香酮、甾族化合物(雌二醇、胆甾醇)等。麝香酮是麝香的主要有效成分之一，具有开窍醒神、活血通经、消肿止痛等功效，且具有双向调节中枢神经系统、抗炎、强心、抑制肿瘤细胞，对缺血性心脏障碍有预防和治疗的作用[1-2]。

麝香中麝香酮常用的检测方法有高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)、气相色谱法(Gas chromatography,GC)、紫外-可见分光光度法(Ultraviolet and visible spectrophotometry,UV)等[3-4]，然而这些方法的检测仪器体积过于庞大，且分析时间较长，一般需要30 min以上，只适用于实验室分析，无法满足现场快检(Point-of-care testing,POCT)需求。

声表面波(Surface acoustic wave,SAW)传感器作为一种声-电换能器，能够在很小的叉指换能器中实现。传感器由两个基本相同的SAW器件与对应的振荡电路构成。一路振荡器与气相色谱结合，使用精密温控来吸附待测气体，作为测试回路；另一路振荡器则作为参考基准，计算差频后可最大程度上消除外围环境如振动、温度等对于振荡器频率稳定性的影响。声表面波传感器面积仅12 mm2，因此检测器体积相对较小[5-6]。

本实验使用中国科学院声学研究所与四川省中医药科学院联合研制的气相色谱-声表面波(GCSAW)联用技术对麝香进行快速检测，其具体的原理框图见图1[5]。在采集阶段，麝香样品通过采样泵进入预浓缩管，在预浓缩管麝香样品挥发性成分被吸收；在进样分析阶段，切换六通阀，载气瓶中的氮气把预浓缩管(温度升高至250°C)中采集到的样品带入色谱柱。化合物进入色谱柱，色谱柱只有1 m长，采用柱上升温系统，使得色谱柱升温速率较快，达到10°C/s。不同化合物在色谱柱分离效果会不一样，其到达检测器的时间也会不同，根据化合物出峰时间进行定性分析；不同质量的化合物会引起检测器频率发生改变，根据检测器频率的变化量可对物质进行定量分析。

图1 声表面波气相色谱仪原理框图[5]Fig.1 Principle block diagram of SAW gas chromatograph[5]

利用GC-SAW联用技术对麝香易挥发性成分进行定性、定量分析，具有分析操作简便、体积小、分析速度快等特点，可实现化合物的广谱(挥发和半挥发性有机物)、高灵敏度(10-12级)、快速(＜5 min)分析[5]，适合于现场分析。目前GC-SAW在水质监测、环境、精油等方面体现了较好的应用优势[7-9]，但在中药麝香酮含量的检测还未涉及。本文研究了GC-SAW在中药麝香检测中的方法学应用，为中药麝香中麝香酮的现场快速定量分析提供一种新的快捷的检测技术。

1 材料与方法

1.1 实验耗材与设备

声表面波气相色谱仪：中国科学院声学研究所(谐振型声表面波传感器，基频500 MHz；色谱柱DB-5(1 m×0.18 mm×0.25 μm))。恒温加热器：厦门宇电科技有限公司。

高纯氮气(99.999%)：北京兆格气体科技有限公司。乙醇(≥99.5%)：TEDIA。麝香酮标准溶液(100 mg/mL)，国家标准物质研究中心。S1-S16麝香样品：由四川省中医药科学院方清茂研究员鉴定为中药麝香正品。

1.2 实验方法

1.2.1 麝香酮标准品的配制

标准品配制：取质量浓度为100 mg/mL的麝香酮标准品，经过逐级稀释，分别配制含量为0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、0.8 μg/mL、1.6 μg/mL和3.2 μg/mL的麝香酮标准溶液。

1.2.2 样品的前处理

样品前处理：取干燥的麝香样品20 mg放入试剂瓶中，加入5 mL无水乙醇，超声30 min后，使用0.45 μm微孔滤膜过滤，得到滤液，取20 μL于2 mL无水乙醇中，得到待测样品。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件与系统适应性实验

色谱条件：DB-5色谱柱，初始温度45°C，按10°C/s程序升温至180°C。进样口温度为200°C；检测器温度为40°C；六通阀温度为160°C；载气为99.999%纯度的氮气，3 mL/min；泵吸时间为10 s；分析时间为20 s[10-11]。1.6 μg/mL麝香酮标准溶液进样0.1 μL，如图2所示，麝香酮保留时间为6.62 s，峰形较好，在20 s时间内可达到良好的分离效果。

图2 1.6 μg/mL麝香酮标准溶液测试色谱图Fig.2 Test chromatogram of 1.6 μg/mL muscone standard solution

2.2 标准曲线与检出限

取含量为0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、0.8 μg/mL、1.6 μg/mL、3.2 μg/mL和10 μg/mL的麝香酮标准溶液，在2.1节的色谱条件下分别测试3次，以麝香酮的质量浓度对其响应值(峰面积)均值绘制标准曲线。线性回归曲线方程为y=1830.3x+364.88，相关系数R=0.9976，在0.2～10 μg/mL范围内呈良好的线性关系(图3)。

图3 GC-SAW中不同质量浓度麝香酮的响应标准曲线(n=3)Fig.3 Response standard curves of musk with different concentrations in GC-SAW(n=3)

依据校准曲线的偏差和斜率方法计算麝香酮检测限和定量限，根据已知标准曲线已知质量浓度的响应值，使用Excel中的Linest函数和检出限公式如下：检测限DL=3.3σ/S；定量限QL=10σ/S，其中，σ为标准偏差；S为斜率。计算得到麝香酮检出限为0.158 μg/mL，进样量为0.1 μL，即检出限绝对质量为15.8 pg。计算麝香酮定量限为0.478 μg/mL，进样量为0.1 μL，即定量限绝对质量为47.8 pg。

2.3 精密度实验

对0.2 μg/mL、0.8 μg/mL、3.2 μg/mL三种质量浓度的麝香酮标准溶液分别连续测定6次，计算相对标准偏差(Relative standard deviation,RSD)分别为3.24%、3.09%和2.89%(见表1)。测试结果表明该方法的精密度良好。

表1 不同质量浓度麝香酮标液精密度测试数据(n=6)Table 1 Precision test data of different concentrations of muscone standard solution(n=6)

2.4 重复性实验

取配制好的质量浓度为0.8 μg/mL和3.2 μg/mL麝香酮标准溶液各6瓶，每瓶测定3次取平均值，计算组间的相对标准偏差RSD值，测试结果见表2。测试麝香酮重复性RSD值为4.23%以内，表明该方法的重复性较好。

表2 麝香酮溶液重复性测试数据(n=3)Table 2 Repeatability test data of muscone solution(n=3)

2.5 稳定性试验

取配制好的质量浓度为0.8 μg/mL的麝香酮溶液，放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后分别测定其响应，每瓶测定3次取平均值，表3结果显示，其RSD值为4.49%以内，表明该溶液在24 h内稳定。

表3 麝香酮甲液稳定性测试数据(n=3)Table 3 Stability test data of muscone solution(n=3)

2.6 加样回收率实验

1号干燥麝香样品取6份，每份约10 mg，分别置于试剂瓶中，各加入100 mg/mL麝香酮标准品溶液3.5 μL，再加入无水乙醇5 mL，超声30 min后，使用0.45 μm微孔滤膜过滤，得到滤液，取20 μL混入2 mL无水乙醇中，得到待测样品。进样0.1 μL测试，每瓶测定3次，取平均值计算回收率，结果如表4所示，平均回收率为98.64%，RSD为4.53 %。

表4 不同质量浓度麝香酮标液加样回收率测试数据Table 4 Recovery rate test data of muscone standard solution with different concentrations

2.7 中药麝香样品测试

根据2.1节的测试条件，测试16组不同产地、不同年龄段和不同品种的麝香样品，每组测试3次，1号麝香样品测试结果如图4所示，16组麝香样品中麝香酮的含量如表5所示。

表5 16组样品中麝香酮含量测试结果(n=3)Table 5 Test results of muscone content in 16 groups samples(n=3)

图4 1号麝香样品色谱图Fig.4 Chromatogram of No.1 musk sample

测试16组不同产地、不同品种、不同年龄段的麝香样品，其麝香酮含量在2.10%～3.84%范围内，含量均高于药典要求的2%。从测试结果分析，不同产地、不同品种、不同年龄段的麝香酮含量差异较大。四川圭兴林麝中麝香酮含量最高，且三年生林麝麝香酮含量高于一年生林麝，一年生林麝麝香酮含量为3.45%，三年生麝香酮含量为3.84%。陕西凤县一年生林麝的麝香酮含量最低，为2.10%。三年生的林麝和马麝中麝香酮含量均大于一年生，说明麝香生长年份越长，麝香酮含量越高。不同产地、不同年龄段的马麝和林麝麝香酮含量差异不明显。

3 结论

本实验应用GC-SAW联用技术对麝香中主要成分麝香酮探索性地进行检测，采用柱上升温系统，7 s内可检出麝香酮。使用GC-SAW联用技术实现了对麝香酮定性、定量检测，且具有较好的响应特性、精密度、重复性和稳定性。本文通过液体进样对麝香酮进行定量分析，定量测定在0.2～10 μg/mL范围内有较好的线性，麝香酮的最低检出限为15.8 pg。测试16组麝香样品，麝香酮含量最高的为四川圭兴林麝，含量最低的为陕西凤县林麝，三年生的麝香酮含量均大于一年生，与中草药报道的爵香产量从麝一岁到三岁半呈递增速度相符合[12-13]。麝香酮作为麝香质量的控制指标之一，采用GC-SAW对麝香中主要成分麝香酮进行定量分析，可用于指导中药麝香质量评价。

本文分析GC-SAW在检测麝香酮定量分析的潜在应用，为中药麝香现场检测快检提供一种新的分析技术。在此研究的基础上与中国药典方法进行比较，中国药典中使用传统气相色谱法测试麝香酮含量，测试一个样品需要30 min以上，取样量需要为200 mg，而GC-SAW分析方法可在几十秒内可实现快速检测，取样量只需要20 mg，在皮克级、纳克级显示出良好的灵敏度。因此，GC-SAW新方法有望作为分析中药麝香的替代分析技术，提供简单、快速、高灵敏度的分析方法。