lncRNA BLACAT1通过靶向miR-374b-5p对卵巢癌细胞紫杉醇耐药性的影响及其机制

赵磊 王一斐 薛国勇

(南阳市中心医院 1药剂科，河南 南阳 473000；2妇科)

卵巢癌是全球第二常见的妇科恶性肿瘤，由于卵巢恶性肿瘤早期病变多无症状、不易发现，约75%病例在晚期诊断出来〔1〕。化疗是晚期卵巢癌的主要治疗手段，紫杉醇(Taxol)在卵巢癌化疗中尤为重要，其和顺铂的联合应用已成为卵巢癌患者的标准化疗方案，然而由于Taxol耐药性的出现极大限制了其临床应用范围，降低其临床疗效〔2，3〕。因此，探索卵巢癌进展和耐药的分子机制对提高卵巢癌患者的生存率至关重要。近年研究发现，长链非编码RNA(lncRNA)在恶性肿瘤的进展和耐药中发挥重要作用〔4，5〕。膀胱癌相关转录本(BLACAT)1在胃癌奥利沙铂耐药组织和细胞中上调表达，抑制其表达可促进胃癌细胞凋亡，抑制细胞迁移，提高胃癌细胞对奥利沙铂的敏感性〔6〕；BLACAT1在非小细胞肺癌顺铂耐药和阿法替尼耐药细胞中表达上调，干扰其表达可降低非小细胞肺癌细胞对顺铂和阿法替尼的耐药性〔7，8〕。但BLACAT1在卵巢癌中的表达及其对卵巢癌细胞Taxol耐药性的影响尚不清楚。miR-374b-5p在卵巢癌中表达下调，上调miR-374b-5p可抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和上皮间质转化，提高卵巢癌细胞对顺铂的敏感性〔9〕。生物信息学分析显示，miR-374b-5p是BLACAT1的潜在靶基因，但BLACAT1能否通过靶向调控miR-374b-5p表达影响卵巢癌细胞Taxol耐药性目前还尚未可知。本研旨在阐明BLACAT1对卵巢癌细胞Taxol耐药性的影响和调控机制。

1 材料与方法

1.1实验材料 收集2017年1月至2018年6月于南阳市中心医院确诊并进行手术切除的20例卵巢癌组织和与其对应的癌旁组织(距离癌灶2 cm)，患者在术前均接受化疗，均签署知情同意书。该研究经医院伦理委员会批准。卵巢癌细胞株SKOV3购于中科院上海生命科学研究院细胞资源中心；人卵巢癌Taxol耐药细胞株SKOV3/Taxol购于广西医科大学附属肿瘤医院；RPMI1640培养基、胎牛血清、青链霉素双抗购于美国Gibco公司；脂质体LipofectamineTM2000购于美国Invitrogen公司；Trizol一步法总RNA提取试剂购于上海联硕生物科技有限公司；si-NC、si-BLACAT1、miR-NC、miR-374b-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-374b-5p、pcDNA、pcDNA-BLACAT1及WT-BLACAT1、MUT-BLACAT1的构建均由上海吉玛制药有限公司提供；细胞计数试剂盒(CCK)-8、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)细胞凋亡检测试剂盒、放射免疫沉淀试验(RIPA)细胞裂解液、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒、聚偏氟乙烯(PVDF)膜购于上海碧云天生物技术有限公司；细胞周期蛋白(Cyclin)D1兔单克隆抗体、P21兔单克隆抗体、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2兔单克隆抗体、Bcl-2相关X蛋白(Bax)兔多克隆抗体及辣根过氧化物酶(HRP)标记的Ⅱ抗购于美国Abcam公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养和细胞转染 采用RPMI1640培养基(含10%胎牛血清，青霉素100 U/ml，链霉素100 mg/ml)在37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中分别培养SKOV3和SKOV3/Taxol细胞。将SKOV3/Taxol细胞以每孔2×105个细胞的密度接种在6孔培养板，第2天利用脂质体LipofectamineTM2000分别将si-NC、si-BLACAT1、miR-NC、miR-374b-5p mimics转染至SKOV3/Taxol细胞，转染48 h，检测转染效果，进行后续实验。为进一步验证BLACAT1调控miR-374b-5p表达影响卵巢细胞对Taxol的耐药性，将si-BLACAT1分别与anti-miR-374b-5p或anti-miR-NC共转染至SKOV3/Taxol细胞，经Taxol干预处理后，检测细胞的增殖和凋亡情况。

1.2.2细胞药物处理 将对数期SKOV3和SKOV3/Taxol细胞分别接种至96孔板，当细胞贴壁后每孔分别加入不同浓度Taxol(20、40、80、160、320 ng/ml)干预处理48 h，随后采用CCK-8法测定细胞增殖抑制率。

1.2.3实验分组 分组：Taxol+si-NC组、Taxol+si-BLACAT1组、Taxol+miR-NC组、Taxol+miR-374b-5p组、Taxol+si-BLACAT1+anti-miR-NC组和Taxol+si-BLACAT1+ anti-miR-374b-5p组。以上各组在转染后，均采用40 ng/ml Taxol干预处理48 h。

1.2.4实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测BLACAT1和miR-374b-5p的表达水平 收集临床样本、SKOV3细胞及各组SKOV3/Taxol细胞，采用Trizol一步法分别提取组织和各组细胞的总RNA，随后进行反转录制备cDNA，然后以cDNA为模板进行荧光定量PCR检测。反应体系(20 μl)：cDNA为2 μl，上游引物(10 μmol/L)0.5 μl，下游引物(10 μmol/L)0.5 μl，SYBR Green Mix 10 μl，RNase-Free水7 μl。引物序列为：BLACAT1上游引物5′-CCTGCTTGGAAACTAATGACC-3′，下游5′-AGGCTCAACTTCCCAGACTCA-3′；miR-374b-5p上游引物5′-TCAGCGGATATAATACAACCTGC-3′，下游5′-TATCGTTGTTCTCCACTCCTTCAC-3′;U6上游引物5′-ATTGGAACGATACAGAGAAG-ATT-3′，下游5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)上游引物5′-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，下游5′-CAAAGTTGTCATGGATGHACC-3′。采用2-ΔΔCt法计算BLACAT1和miR-374b-5p的相对表达量。

1.2.5CCK-8法检测细胞增殖活力 取对数生长期的细胞接种于96孔板，当细胞融合度为60%时按照1.2.3分组进行转染，48 h后每孔加入Taxol浓度为40 ng/ml的培养液100 μl，培养48 h后，每孔加入CCK-8试剂10 μl，继续培养4 h在酶标仪测定450 nm波长处吸光度(OD)值，计算细胞增殖抑制率。抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.6流式细胞术检测细胞凋亡 用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰蛋白酶消化各组SKOV3/Taxol细胞，并用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，离心后，用结合缓冲液重悬细胞，调整细胞浓度为1×106个/ml。取100 μl细胞悬液加入到流式管内，随后加入5 μl的Annexin V-FITC，混匀后，室温避光孵育10 min，再加入10 μl PI溶液，继续孵育5 min，补加PBS至500 μl，流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

1.2.7Western印迹检测增殖、凋亡相关蛋白表达水平 采用RIPA细胞裂解液提取各组细胞蛋白后，按照BCA试剂盒测定蛋白浓度。取适量细胞蛋白和上样缓冲液混合后，沸水浴5 min变性细胞蛋白。按照每孔30 μg变性蛋白样品进行上样，随后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析细胞蛋白。电泳完毕后，利用湿法转膜装置将蛋白转至PVDF膜，随后将膜在5%脱脂牛奶中室温封闭1 h，吸尽封闭液，洗膜缓冲液漂洗3 min，加入Ⅰ抗4℃孵育过夜，洗膜液漂洗5 min，漂洗3次后，加入相应的Ⅱ抗室温孵育1 h，洗膜液再次漂洗3次后，采用电化学发光(ECL)试剂进行显色，拍照后，采用Image J软件分析目的条带灰度值。

1.2.8双荧光素酶报告基因实验 采用StarBase在线预测显示，BLACAT1的3′UTR含有与miR-374b-5p互补的核苷酸序列，猜测miR-374b-5p是BLACAT1的靶基因，随后采用双荧光素酶报告基因实验进行验证。利用LipofectamineTM2000将含有BLACAT1的3′UTR的WT荧光素酶报告基因载体WT-BLACAT1和MUT荧光素酶报告基因载体MUT-BLACAT1分别与miR-374b-5p mimics和miR-NC共转染至SKOV3/Taxol细胞，转染48 h后分别收集各组细胞，按照双荧光素酶报告基因试剂盒说明书测定荧光素酶活性。

1.3统计学方法 采用SPSS20.0软件进行t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1lncRNA BLACAT1和miR-374b-5p在卵巢癌组织中的表达 与癌旁组织比较，卵巢癌组织中BLACAT1表达水平显著升高，miR-374b-5p表达水平显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 BLACAT1和miR-374b-5p在卵巢癌组织中的表达

2.2lncRNA BLACAT1和miR-374b-5p在卵巢癌细胞和卵巢癌Taxol耐药细胞中的表达 与卵巢癌细胞SKOV3比较，卵巢癌Taxol耐药细胞SKOV3/Taxol中BLACAT1表达水平显著升高，miR-374b-5p表达水平显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 BLACAT1和miR-374b-5p在卵巢癌细胞和卵巢癌紫杉醇耐药细胞中的表达

2.3Taxol对卵巢癌细胞和卵巢癌Taxol耐药细胞的抑制作用 SKOV3细胞和SKOV3/Taxol细胞中，随着Taxol剂量增高，细胞抑制率均显著升高，且同一剂量Taxol，SKOV3/Taxol细胞抑制率显著低于SKOV3细胞(P<0.05)；SKOV3/Taxol细胞IC50(631.21±41.21)显著低于SKOV3细胞(109.90±9.11，P<0.05)。见表3。

表3 不同浓度Taxol对卵巢癌细胞和卵巢癌Taxol耐药细胞抑制率的影响

2.4沉默BLACAT1联合Taxol(40 ng/ml)对SKOV3/Taxol细胞增殖和凋亡的影响 与Taxol+si-NC组比较，Taxol+si-BLACAT1组SKOV3/Taxol细胞BLACAT1、CyclinD1和Bcl-2蛋白表达水平显著降低，miR-374b-5p、p21、Bax蛋白水平、细胞增殖抑制率和凋亡率均显著增加(均P<0.05)。见图1、表4。

2.5过表达miR-374b-5p联合Taxol对SKOV3/Taxol细胞增殖和凋亡的影响 与Taxol+miR-NC组比较，Taxol+miR-374b-5p组SKOV3/Taxol细胞CyclinD1和Bcl-2蛋白表达水平显著降低，miR-374b-5p、p21和Bax蛋白水平、细胞增殖抑制率和凋亡率均显著增加(均P<0.05)。见表5、图2。

2.6lncRNA BLACAT1靶向调控miR-374b-5p的表达 利用StarBase在线预测显示，BLACAT1的3′UTR含有与miR-374b-5p互补的核苷酸序列，见图3。与miR-NC和WT-BLACAT1共转染组比较，miR-374b-5p mimics和WT-BLACAT1共转染组SKOV3/Taxol细胞的荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；与miR-NC和MUT-BLACAT1共转染组比较，miR-374b-5p mimics和MUT-BLACAT1共转染组SKOV3/Taxol细胞的荧光素酶活性无统计学意义(P>0.05)。见表6。与pcDNA组SKOV3/Taxol细胞miR-374b-5p表达水平(1.00±0.09)比较，pcDNA-BLACAT1组(0.42±0.04)显著降低(P<0.05)；与si-NC组SKOV3/Taxol细胞miR-374b-5p表达水平(0.99±0.08)比较，si-BLACAT1组(2.24±0.23)显著升高(P<0.05)。提示miR-374b-5p是BLACAT1的靶基因，BLACAT1负性调控miR-374b-5p表达。

表6 双荧光素酶报告实验

2.7干扰miR-374b-5p表达逆转沉默BLACAT1对SKOV3/Taxol细胞耐药性 与Taxol+si-BLACAT1+anti-miR-NC组比较，Taxol+si-BLACAT1+anti-miR-374b-5p组SKOV3/Taxol细胞CyclinD1和Bcl-2水平、miR-374b-5p、p21和Bax水平、细胞增殖抑制率和凋亡率显著降低(P<0.05)。见图4、表7。

3 讨 论

卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤，获得性耐药是导致卵巢癌患者死亡的主要原因〔10〕。Taxol作为治疗卵巢癌的一线化疗药物，其和顺铂联合使用初期效果较好。然而，大多数患者在治疗1～2年后会出现化疗耐药和复发，其中位无进展生存期仅为12～16个月，5年存活率仅为27%〔11〕。lncRNAs是一种非蛋白编码转录本，其在卵巢癌的发生、转移和预后中发挥调控作用〔12〕。研究表明lncRNA表达失调与卵巢癌细胞Taxol耐药有关。例如，lncRNA KB-1471A8.2在卵巢癌组织和耐药卵巢癌细胞中均显著下调，过表达KB-1471A8.2可显著抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭、迁移和Taxol耐药，诱导卵巢癌细胞的凋亡〔11〕；然而，LINC01118在卵巢癌组织和耐药细胞中呈高表达，LINC01118可抑制卵巢癌细胞凋亡，促进细胞迁移、侵袭和Taxol耐药〔13〕。本研究结果提示BLACAT1的表达上调可能与卵巢癌细胞的Taxol耐药有关。随后构建沉默BLACAT1的SKOV3/Taxol细胞株，发现沉默BLACAT1可抑制SKOV3/Taxol细胞增殖，促进Taxol诱导的细胞凋亡，提高卵巢癌细胞对Taxol的敏感性。

miR-374b-5p的表达失调与人类多种疾病相关，包括肿瘤。研究发现miR-374b-5p在乳腺癌中表达上调〔14〕；然而miR-374b-5p在膀胱癌中表达下调发挥抑癌基因作用〔15〕。此外，miR-374b-5p和胰腺癌细胞的吉西他滨耐药相关，其胰腺癌耐药细胞中的表达低于药物敏感性的细胞，过表达miR-374b-5p可改善胰腺癌细胞对吉西他滨药物的耐药性〔16〕。本研究结果提示，沉默BLACAT1通过上调miR-374b-5p可提高卵巢癌细胞对Taxol的敏感性。在后续研究中，将开展体内实验进一步验证BLACAT1/miR-374b-5p轴在卵巢癌细胞Taxol耐药中的作用。

综上，lncRNA BLACAT1在卵巢癌组织和Taxol耐药卵巢癌细胞中呈高表达，而miR-374b-5p呈低表达，沉默BLACAT1通过上调miR-374b-5p可抑制卵巢癌细胞增殖，促进Taxol诱导的细胞凋亡，提高卵巢癌细胞对Taxol的敏感性。BLACAT1/miR-374b-5p轴有望成为Taxol耐药卵巢癌的分子治疗靶点。